Diagnostic direct en microbiologie





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L3 médecine AMIENS 2012/2013 – S5 UE1 – Dr H MAMMERI - Diagnostic direct

Diagnostic direct en microbiologie

  • Sert à mettre en évidence directement la bactérie ou ses constituants

  • L'examen microscopique peut permettre de mettre en évidence la bactérie/le virus après coloration, recherche des Ag avec savonnette,

  • La PCR permet d'identifier le génome.

  • La culture consiste à faire pousser le germe, une fois isolé on peut l'identifier.

  • Avantages du dg direct par rapport à l’indirect :

    • SPECIFICITE (on est sûr de la présence)

    • Une fois le germe isolé, on peut faire son ANTIBIOGRAMME

    • Pas encore d’apparition de beaucoup d’Ac (fenêtre sérologique)

1L'examen microscopique direct


  • Lorsqu'on reçoit un prélèvement on l'étale sur des lames à l'état frais (sans coloration) : parasites (œuf), certaines levures, certains dermatophytes ou après coloration.

  • On ne peut pas voir les virus au microscope optique.

1.1Coloration de Gram :


  • On colore le peptido-glycane avec du violet de gentiane, ensuite on décolore avec alcool (90°), les bactéries avec une couche de peptido-glycanes mince (Gram -) vont se décolorer alors que celles qui ont une couche épaisse vont rester colorées en violet (Gram +), ensuite on colore à la fuschine, les bactéries qui s'étaient colorées le restent, alors que celles qui s'étaient décolorées deviennent rose/rouge.

  • Permet la détermination d’une antibiothérapie probabiliste

1.2Coloration de Ziehl :


  • Une couche externe d'acide mycolique (sorte de cire) apporte les propriétés tinctoriales des mycobactéries

  • Le prélèvement est coloré par fuschine à chaud, toutes les bactéries deviennent rouges, ensuite on les trempe dans un mélange alcool/acide qui décolore la paroi des bactéries standards. On les colore ensuite au bleu de méthylène qui contre colore en bleu les bactéries sans cette couche spéciale d'acide mycolique qui elles restent rouge.

  • BAAR bacile acido-alcolo résistant : rouge foncé au microscope

1.3Coloration de May Grunwald Giemsa (MGG) :


  • En hématologie pour identifier les parasites hématophages +++, c'est une coloration cytologique, recherche du Plasmodium falciparum (paludisme).

1.4Coloration de MIF :


  • Pour des parasites dans le caca 

  • On rajoute une goutte de MI(L)F^^, la coloration imprègne les parasites et les met en évidence au microscope.

1.5Immunoflurorescence directe :


  • On étale le prélèvement sur une lame, on dépose sur le frottis des Ac marqués par un fluorochrome, qui sont spécifiques du germe que l'on recherche.

  • On observe au microscope à fluorescence.

2Recherche d'antigènes


  • Deux types :

    • Soit sur germe intact

    • Soit recherche d’Ag soluble après explosion d’une bactérie dans un liquide biologique (ex : urine)

  • On dispose de 2 types de techniques :

    • immunochromatographie : savonnette (test de grossesse) le prélèvement est déposé en bas d'une bandelette imprégnée d'Ac spécifique, le prélèvement migre par capillarité et rencontre les Ac.

    • Méthode par agglutination de billes de latex : si le liquide biologique ne contient pas d'Ag, les billes de latex restent solubles et le mélange reste bien homogène. Si l'Ag est présent, les billes vont former des réseaux, des agrégats se forment et le fond devient translucide. C'est une technique moins sensible et moins spécifique que les techniques par savonnette.

3Recherche par amplification génique : PCR


  • Extraction de l’ADN

  • Amplification par PCR (1 à 3h)

  • Révélation sur gel par un intercalant (le BET)  UV

  • On peut également faire une RT-PCR avec des sondes Taq man…

  • Pour plus d’infos sur la PCR cf cours de bio mol PACES.

  • Avantages : techniques assez rapide, permet un diagnostic rétrospectif en cas d'infections décapitées (traitement probabiliste déjà débuté) les bactéries sont mortes mais on peut encore les mettre en évidence. C'est aussi une technique très sensible, peu de bactéries/virus sont nécessaires car l'amplification augmente la présence antigénique.

  • Inconvénients : techniques nécessitant un équipement spécifiques (pas réalisables dans tous les labos)

  • La PCR est très utilisée en virologie car les autres examens directs ne marchent pas, la culture ne fonctionne pas non plus (HIV, HCV (hépatite C), HSV, CMV, entérovirus)

  • En bactériologie elle est un peu moins utilisée, elle l'est surtout pour les bactéries à développement intracellulaires strictes (Chlamydia). Ou les bactéries à croissance lente (ex : BK)

  • PCR universelles :

    • amorces non spécifiques.

    • Ex : endocardite à hémocultures négatives, on vise alors l'ARN 16S présent sur toutes les bactéries, il existe une toute petite homologie à tous ces ARN qui permettent d'identifier les primer dégénérés.

    • Puis on compare le gène obtenu par PCR par rapport à d'autres gènes dans des bases de données : séquençage.

4Recherche par culture :


  • Consiste à isoler le germe et à l'identifier.

  • Bactériologie et mycologie +++

  • Nécessite d'utiliser un milieu de culture, une température de culture, des conditions atmosphériques et un délai d'incubation appropriés.

  • Milieu ordinaire : trypticase soja : milieu non enrichi permet aux bactéries prototrophes de pousser.

  • Les milieux enrichis en sang/sang cuit (= gélose chocolat) :

    • La chaleur permet de détruire les protéines thermolabiles qui inhibent la croissance de certaines bactéries comme Haemophilus sp.

  • Milieu sélectif : contiennent des ATB, quand on veut isoler une bactérie dans une flore commensale polymicrobienne qu'il faut tuer.

    • Ex : gélose Hektoen éradique Escheriachia coli et sélectionne Salmonelles et Shigella dans les selles.

    • Gélose BCYE spécifiques aux légionelles

  • On incube ensuite dans des étuves à 37° en 24 à 48h.

  • Puis on met les bactéries obtenues en solution et on les identifie grâce à des techniques biochimiques (identification biochimique grâce à une galerie).

  • On peut aussi les identifier par spectrométrie de masse : système MALDI TOF.

  • Culture cellulaire : pour l'isolement des germes intracellulaires stricts : virus (herpès), certaines bactéries intracellulaires strictes (Chlamydia)


5Examen cyto-bactériologique :


  • ECBU (examen cyto-bactériologique urinaire).

  • Si on veut faire une recherche spécifique : légionelles, mycobactéries, Bordetella pertussis il faut faire une demande spécifique.




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