D’un organisme est l’information stockee dans son materiel genetique: la sequence des bases (nucleotides) dans son adn. Cette sequence dicte quelles proteines





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date de publication25.10.2016
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GENETIQUE BACTERIENNE
Le genotype d’un organisme est l’information stockee dans son materiel genetique: la sequence des bases (nucleotides) dans son ADN. Cette sequence dicte quelles proteines ou molecules d’ADN peuvent etre produites par l’organisme, comment les genes peuvent etre regules et la fonction de la proteine une fois synthetisee. Pas toutes les proteines ne sont synthetisees en meme temps et le genotype complet d’un organisme ne peut etre decouvert, a moins que le genome ne soit sequence. Ce qui est observable et mesurable constitue le phenotype de l’organisme, c’est-a-dire les manifestations du genotype par des caracteristiques comme la capacite a produire une capsule ou la resistance a un antibiotique. Des alterations du genotype peuvent donc retentir sur le phenotype.

Bien que dans la nature, il peut y avoir un nombre important d’individus d’une espece ayant des phenotypes legerement differents, les microbiologistes, en particulier les geneticiens microbiens, essaient de travailler avec des organismes genetiquement identiques. Par consequent, en laboratoire, on travaille avec des cultures pures ou les microbes descendent d’un seul parent, afin de minimiser toute variabilite genetique. Ce parent peut souvent etre designe comme type sauvage.
Modification (variation) du message
L’ADN peut subir des modifications. Ainsi, au cours de la replication, on croit que toutes les 108-109 bases environ, un nucleotide “errone” est incorpore dans le nouveau brin. Des changement plus importants peuvent etre provoques par des mutagenes physiques et chimiques, par recombinaison, par les elements transposables et par transfert de genes. En outre, le genome cellulaire peut etre complete par des plasmides et par d’autres molecules d’ADN “supplementaire”.
Les mutations
La variation genotypique (ou mutation) est une modification spontanee ou provoquee, transmissible de facon stable dans la descendance et resultant d’une modification du genome bacterien.

Des mutations peuvent se produire spontanement a faible frequence (de 10-6 a 10-12) sans cause externe evidente. Ce sont principalement des erreurs de replication ou de reparation.

L’apparition des mutations est stimulee (provoquee) par les mutagenes. Ceux-ci peuvent etre des agents physiques, comme les rayons ultraviolets et les rayons X, ou des substances chimiques, comme les agents alkylants, le disulfite, l’acide nitreux, etc.

Une cellule qui a subi une mutation s’appelle un mutant. Les mutations sont souvent nocives – et peuvent etre letales si elles affectent une sequence de nucleotides qui code pour une fonction ou un produit letal. Les mutations benefiques incluent, par exemple, celles qui augmentent la resistance de la cellule a des antibiotiques. Ainsi, une mutation peut avoir pour resultat un ribosome modifie de telle sorte que la streptomycine ne s’y fixe plus et, par consequent, n’inhibe plus la synthese proteique.

Une mutation qui rend la cellule mieux adaptee aux conditions de croissance peut permettre a cette cellule de supplanter dans la population les autres individus non-mutants (de type sauvage) et d’y devenir numeriquement dominante. Cette selection naturelle constitue le fondement du concept d’evolution.
Les types de mutations

Les mutations se produisent de differentes facons. Les changement dans la sequence d’ADN vont d’un changement d’une base isolee (perte, acquisition, substition d’un seul nucleotide), apele mutation ponctuelle, a des rearrangement etendus du genome, parfois appeles mutations multisites, qui comprennent des segments courts ou longues d’ADN et peuvent atteindre plusieurs genes.
Transfert de materiel genetique
Si la mutation modifie de facon durable le partimoine genetique des bacteries, son apparition reste accidentelle et sa selection l’exception; en revanche, les autres mecanismes assurant une modification du patrimoine genetique sont tres efficaces et leur transmission se fait a la descendance mais aussi a d’autres bacteries. Ces modifications se realisent par transfert de materiel genetique. Du nouveau ADN peut penetrer dans une bacterie par transformation, conjugaison ou transduction.
La transformation. C’est le transfert d’un fragment d’ADN d’une bacterie donatrice a une bacterie receptrice. Ce phenomene est frequent chez les bacteries Gram positives, mais s’observe aussi chez certaines bacteries Gram negatives. L’ADN d’une bacterie donatrice, libere naturellement lors d’une lyse bacterienne, est transfere sous forme libre a une bacterie receptrice. La bacterie receptrice doit etre dans un etat receptif, dit de competence, caracterise par la presence de recepteurs specifiques de l’ADN a la surface bacterienne. La penetraion de l’ADN de la donatrice s’accompagne d’une hydrolyse de l’un des deux brins de la molecule et l’integration de l’ADN exogene dans le chromosome de la receptrice se fait par recombinaison legitime.

La transformation a ete utilisee dans la cartografie du genome et elle est surtout a la base de certaines methodes d’ingenierie genetique, applicable a de nombreuses especes.
La conjugaison. C’est le mecanisme par lequel le materiel genetique est transfere entre deux bacteries par des plasmides. Les plasmides conjugatifs (F+, fertilite +) ont la capacite de se transferer entre les cellules et, dans certains cas, de transferer des segments d’ADN chromosomique. Les plasmides F et leurs apparentes portent un groupe de genes appele genes tra qui codent pour toutes les proteines requises pour appariement avec une autre bacterie ne contenant pas de plasmide F. L’ADN est ensuite transfere de la cellule F+ au receveur, la cellule F-.

Chez les bacteries Gram positives les cellules receptrices secretent de petites quantites d’une substance (une pheromone) qui provoque chez les cellules donneuses la synthese d’un composant adhesif de la surface cellulaire. L’ADN est transfere entre cellules donneuse et receptrice adherant l’une a l’autre.

Les cellules Gram negatives contenant des plasmides F (F+) produisent des pili speciaux a leur surface, codes par des genes tra. Ce sont des structures filamenteuses proteino-aqueuses qui se lient a la surface des cellules F- pour former une paire. Le pilus F se retracte au contact, mettant les deux cellules tres proches l’une de l’autre.

Ce contact cellulaire etroit permet ulterieurement le passage de l’ADN de la donatrice vers la receptrice. Une copie simple brin du plasmide F est transferee dans la cellule receveur. Elle est produite par une replication en cercle roulant. La synthese d’un brin complementaire d’ADN se fait dans la cellule receveur. Le plasmide F est transfere de facon a ce que les derniers genes a transferer soient les genes tra. Le plasmide devient circulaire dans le receveur et la paire se separe.

Certains plasmides F en s’integrant dans le chromosome de la bacterie donatrice sont capables de le mobiliser et de permettre son introduction dans une autre bacterie de meme espece. Cet ADN chromosomique peut s’integrer dans le chromosome du receveur par recombinaison homologue. Les souches qui ont un plasmide F integre dans leur chromosome sont appelees souches Hfr (“high-requency recombination), car elles permettent le transfert de genes chromosomiques d’une souche a une autre a haute frequence.
La transduction. Le transfert d'ADN chromosomique (ou plasmidique) d'une cellule a une autre, via un phage, s'appelle la transduction.

La transduction generalisee. Par ce processus, n'importe quel gene peut etre transfere d'une cellule a l'autre. Il arrive occasionnellement que, dans une population de bacteries infectees, au cours de l'assemblage des particules de phages, de l'ADN chromosomique ou plasmidique soit incorpore au lieu de l'ADN du phage. Une fois liberes, de tels phages cellulaire anormaux peuvent s'attacher a d'autres cellules et injecter leur ADN, mais comme ce n’est pas de l'ADN de phage, il n’en decoule ni lysogenie, ni lyse.

Dans la cellule receptrice (le transductant), l'ADN transduit peut (a) etre degrade par les endonucleases de restriction; (b) se recombiner avec le chromosome (ou le plasmide) de telle sorte que certains genes de la cellule donneuse puissent etre transmis de facon stable (transduction complete); (c) persister sous forme d'une molecule stable mais ne se repliquant pas (transduction abortive). Si un transductant abortif donne naissance a une colonie, une seule cellule de la colonie contient l'ADN transduit.

Les genes transduits avec un promoteur fonctionnel (qu'il s'agisse d'une transduction complete ou abortive) peuvent etre exprimes dans le transductant.

La transduction specialisee (restreinte).La transduction specialisee ne peut etre le fait que d'un phage tempere qui passe par une phase d'integration dans le chromosome de l'hote. Lors de l'excision, un prophage emportera occasionnellement un fragment adjacent du chromosome, abandonnant souvent certains de ses genes situes a son extremite opposee. Un tel genome recombinant peut ensuite etre empaquete dans une tete de phage et le reste du phage s'assembler normalement. Ce phage peut infecter a nouveau une bacterie et s’y integrer. La bacterie devient porteuse d’un gene provenant de la bacterie donatrice.
La transposition est le transfert d’un petit morceau spécialisé d’ADN d’un site à un autre dans le même duplex, ou à un site dans un duplex différent de la même cellule. Les éléments transposables se trouvent dans les chromosomes bactériens, dans l’ADN des phages et dans les plasmides. Habituellement, la transposition est un événement rare. Il peut en résulter une variété de réarrangements – incluant des insertions, des délétions et des inversions.
La recombinaison – est le réarrangement d’une ou plusieurs molécules d’acides nucléiques: les molécules peuvent, p.ex., s’associer, séparer ou échanger leurs brins, ou encore une séquence au sein d’une molécule peut être perdue ou inversée, etc.

La recombinaison homologue implique un échange de brins entre deux duplex. Ceci ne peut se produire que si une longue séquence de nucléotides dans l’un des deux duplex est très similaire à une séquence de l’autre duplex: autrement dit, les deux séquences doivent présenter de grandes régions d’homologie. La recombinaison homologue s’observe, par exemple, lors de l’interaction plasmide-chromosome.

Dans la recombinaison localisée, deux séquences spécifiques du duplex sont rapprochées l’une de l’autre, une protéine spécifique (une recombinase) se fixant à la région de juxtaposition. La recombinaison localisée est impliquée dans l’intégration de l’ADN d’un bactériophage dans le chromosome d’une bactérie.
GENIE GENETIQUE ou technique de l’ADN recombinant

Il est possible de manipuler et de modifier des AN in vitro et de les introduire ensuite dans des cellules pour les repliquer et les exprimer. Cette technologie permet de modifier des cellules de facon tres specifique. Des bactéries, leurs enzymes et plasmides sont aussi largement employées pour la manipulation de l’ADN. On peut par exemple faire synthetiser des proteines de mammifere par des bacteries. Certaines bactéries ont ainsi été changées de telle sorte qu’elle peuvent fabriquer des produits utiles pour l’industrie, l’agriculture ou la médecine. Par exemple, la streptokinase est une enzyme qui, dans la nature, est produite par certaines especes de Streptococcus. Elle a la capacite de convertir le plasminogene humain in plasmine (fibrinolysine), une enzyme qui desagrege ls caillots de fibrine. L’interet de la streptokinase comme agent therapeutique est lie a sa capacite de solubiliser la fibrine et de ce fait, a sa valeur dans le traitement des thromboses. Comme source commerciale de streptokinase, les streptocoques sont de pietres producteurs. En exprimant le gene de la streptokinase dans Escherichia coli, on obtient un rendement plus de 10 fois superieur.

Un autre procede de l’ADN recombinant, le clonage (clonage moléculaire) est une technique très frequemment utilisée. Le clonage est une méthode visant à obtenir de nombreuses copies d’un gène ou d’un autre morceau d’ADN (pour l’analyser, pour fabriquer des sondes (amorces), ou pour la production à grande échelle du produit du gène). Le gène est d’abord isolé, puis il est inséré dans ce qu’on appelle un vecteur (un plasmide ou un bactériophage). Le hybride peut alors être introduit dans une bactérie, par exemple, par transformation. Ainsi, le gène est copié chaque fois que le plasmide se réplique, et par conséquant, beaucoup de copies du gène “cloné” sont produites. Pour récolter le gène, on lyse les bactéries. Certains réactifs, ajoutés au cours du processus, permettent la séparation des acides nucléiques du reste des débris cellulaires. Les plasmides peuvent alors être isolés par centrifugation spécialisée. En utilisant l'endonucléase de restriction originale, on peut exciser le gène cloné de chaque plasmide et le séparer de l’ADN plasmidique, au moyen d’une électrophorèse sur gel d’agarose.

LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE



Les techniques de biologie moléculaire sont destinées à mettre en évidence les acides nucléiques (AN). Elles sont utilisables dans le diagnostic des infections aigues ou chroniques, dans le suivi thérapeutique, ainsi que dans les domaines de la physiopathologie, de l’épidémiologie, de l’environnement, etc.

Les techniques moléculaires reposent sur la capacité d’une séquence monocatenaire d’AN (ADN ou ARN), à se lier spécifiquement avec sa séquence complémentaire, dans des conditions définies (concept d’hybridation moléculaire).

Tous les sites anatomiques et tous les liquides biologiques peuvent faire l’objet de prélèvement pour diagnostic moléculaire. Tout d’abord, un traitement adéquat du prélèvement est nécessaire pour libérér la cible de son environnement (étape d’extraction) et la dénaturer, c’est-à-dire la présenter sous forme monocatenaire. Dès lors, cette cible peut être détectée par des techniques d’hybridation simple. La sensibilité de ces techniques peut être accrue par amplification. Le résultat peut être qualitatif (réponse en tout ou rien) ou quantitatif: dans ce dernier cas, on donne la réponse en nombre de copies par ml de plasma, ou pour un nombre donnée de cellules, ou par μg d’ADN extrait.

L’étape d’extraction des AN est fondamentale puisque de sa qualité vont dépendre la qualité finale de la réaction et donc le résultat. De nombreuses techniques d’extraction sont disponibles:

  1. l’extraction par des solvants organiques, suivie de la précipitation des AN par éthanol;

  2. la fixation-élution des AN sur de la silice;

  3. la compléxation des protéines à une résine et récuperation des AN.

La conservation des extraits d’AN doit impérativement se faire à –80° C, du fait du risque de dégradation au cours du temps.
Hybridation directe (simple)

L’hybridation avec une sonde (amorce) complémentaire est réalisée dans des conditions définies de t°, de pH et de force ionique. La révélation du test est effectuée après l’immobilisation des hybrides et l’élimination des élements non-réactifs.

L’hybridation en milieu liquide est effectuée en tubes ou en cupules de plaques de microtitration. La séparation des hybrides peut être réalisée par chromatographie sur colonne, ou, le plus souvent, par capture sur un support solide par des anticorps antihybride. La détection est effectuée à l’aide d’anticorps spécifiques marqués. La lecture peut être réalisée par radiométrie, colorimétrie, chimiluminescence ou fluorimetrie en fonction de la nature du marqueur.

L’hybridation peut être réalisée aussi in situ, ou sur membrane (après l’électrophorèse des AN en gel d’agarose, puis transfert sur un film de nylon avant d’adjonction de la sonde).

L’hybridation directe manque de sensibilité. Il est par conséquant souvent nécessaire de lui ajoindre une étape d’amplification, soit en accroissant l’intensité du signal de détection, soit en multipliant au départ la séquence cible.

Hybridation avec amplification de la séquence cible


Après extraction et dénaturation destinées à rendre accessible l’AN cible, l’hybridation spécifique d’amorces complémentaires d’une séquence sélectionnée déclenche, en présence de nucléotites triphosphorylés, l’action d’une ou plusieurs enzymes de réplication qui permettent, après un nombre défini de cycles répétitifs, la multiplication exponentielle de la cible. Les produits d’amplification sont détectes par électrophorèse en gel d’agarose après coloration par le bromure d’éthidium ou par hybridation d’une sonde nucléotidique liée à un marqueur mesurable.

La PCR (amplification en chaine par polymérase) est certainement à l’heure actuelle la technique la plus répandue. Elle repose sur la capacité qu’a l’ADN-polymérase d’allonger une amorce. Le mélange de réaction contient: a) l’échantillon d’ADN b) les amorces (sondes) complémentaires; c) l’ADN-polymérase Taq (provient de l’espece bacterienne Thermus aquaticus); d) des désoxyribonucléosides triphosphates. Quand le mélange est chauffé à 95° C, les brins du duplex de l’échantillon se séparent et un refroidissement temporaire à 45° C environ permet aux amorces de se fixer à l’extrémité 3’ de chacun d’eux. On chauffe alors à 72° C et la polymérase Taq allonge chaque amorce en y ajoutant des nucléotides. Deux duplex sont donc formés à partir du duplex original. Le processus est répété un grand nombre de fois.

La détection des ARN est également possible après transcription préalable de l’ARN en ADN complémentaire par une transcriptase réverse.

Les usages de la PCR



Parmi les usages specifiques de la PCR en bacteriologie et en biologie moleculaire, on peut citer:

  1. La fabrication des sondes;

  2. La classification ou taxonomie;

  3. La detection d’une mutation ponctuelle specifique dans une molecule d’ADN dont la sequence de type sauvage est connue;

  4. La detection de sequences d’ADN specifiques d’un pathogene donne dans du materiel clinique, particulierement d’ADN de pathogenes qui ne peuvent pas etre cultives ou qui croissent lentement en culture. La PCR est donc utile pour le diagnostic de certaines maladies et pour les etudes epidemiologiques. La PCR peut confirmer le diagnostic en quelques heures, au lieu de quelques jours (voire semaines) des methodes habituelles.






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