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Proposition d'un sujet de thèse 2016
Apport d’un biomarqueur lipidique pour diagnostiquer l’impact toxique de pesticides
sur le compartiment des diatomées benthiques des cours d’eau.
Application sur un bassin viticole-test du Blayais (33)

Mots clés : diatomées benthiques – cours d’eau – pollution - pesticides – descripteurs d’impact - impact toxique –- biomarqueur lipidique -
Résumé

Les travaux de la présente thèse prennent place dans le cadre du projet LIPID, financé par le LabEx COTE (A.O. 2015). Ce programme écotoxicologique intervient en complément du projet PHYTOCOTE pré-existant, qui diagnostique l’impact des pratiques viticoles sur les milieux naturels d’un site-atelier viti-vinicole du Blayais (bassin versant de Marcillac, 33), et étudie les possibilités d’actions correctives pour une meilleure durabilité environnementale de cette activité. Par cette thèse, leprogramme LIPID vise notamment à améliorer le diagnostic d’écotoxicité des pollutions viticoles sur des cours d’eau-tests (Ruisseau des Souches et Livenne), à partir des réponses procurées par les diatomées aquatiques benthiques.

Le compartiment diatomique est utilisé de longue date dans les réseaux de surveillance nationaux pour diagnostiquer la qualité des cours d’eau. Des indices diatomiques calculés à partir de la composition spécifique des communautés en place (IPS, IBD…) permettent un diagnostic fiable de la qualité des eaux vis-à-vis de pollutions physico-chimiques générales et de l’enrichissement anthropique des cours d’eau (altération organique et eutrophisation). Pour différentes raisons, ces indices ne permettent pas de procurer un diagnostic suffisamment robuste de l’altération toxique in situ. Dans le but d’obtenir un diagnostic plus précoce, plus sensible et plus fiable de ce type de pollution, il a été nécessaire de développer d’autres techniques issues du domaine de l’écotoxicologie. Il a ainsi été possible de mettre en évidence les effets de molécules toxiques sur la croissance des peuplements, sur la biométrie des taxons et l’apparition de formes anormales, sur les atteintes au système photosynthétique et, à partir d’approches de biologie moléculaire, sur l’induction ou l’inhibition transcriptomique de fonctions ou de biosynthèses cellulaires.

Cette dernière approche qui s’appuie sur les ARN totaux, déjà utilisée avec succès sur différents organismes modèles animaux, a récemment permis de révéler de façon précoce et sensible les effets toxiques d’un micropolluant métallique (Cd) et de molécules phytosanitaires sur diatomées d’eau douce.

Cependant, par rapport à ces inductions d’ARN, des objections sont émises du fait de l’existence de régulations cellulaires post-transcriptomiques capables de moduler les réponses et biosynthèses cellulaires en fonction du niveau réel de l’atteinte toxique. Il apparaît donc intéressant d’étudier plus directement le niveau réel des biosynthèses ou des blocages de biosynthèses qui interviennent en réponse à une exposition toxique.

Les profils lipidiques ont déjà été utilisés avec succès sur des organismes végétaux, tenant lieu de proxys permettant de résumer le fonctionnement cellulaire et ses altérations. A partir d’expérimentations d’exposition à des produits toxiques utilisés en viticulture (cuivre, pesticides organiques de synthèse) qui seront réalisées en conditions contrôlées de laboratoire et in situ, le présent projet de thèse vise à transposer sur le compartiment diatomique un principe de biomarqueur lipidomique mis au point sur végétaux terrestres, et à en valider la pertinence et l’intérêt par rapport aux descripteurs d’impact toxique précités.

  1. Contexte général, état de l'art et enjeux


L’évolution des activités humaines mises en jeu dans le cadre du développement économique, industriel et commercial intervenu au cours du 20ème siècle a conduit à un accroissement conséquent de la pollution des écosystèmes aquatiques, du fait du transport de la contamination suivant l’écoulement des eaux et la voie atmosphérique. Si la pollution organique et trophique à l’origine de l’eutrophisation des hydrosystèmes était le problème dominant des années 1960-70, un effort très conséquent a été réalisé dans ce domaine avec l’augmentation et l’amélioration du parc de STEPs urbaines et industrielles, avec un important soutien financier des agences de l’Eau. Une source de nutriments qui échappait le plus à ce type de stratégie, la pollution diffuse agricole, a dû faire l’objet d’autres types de mesures plus territorialisées et plutôt moins efficaces, mais les principaux points noirs d’eutrophisation des eaux douces ont cependant pu être progressivement résolus.

Un problème très actuel qui persiste réside dans la détection de différents types de micropolluants toxiques dans notre environnement naturel (métaux lourds, pesticides, assortiment sans cesse accru de substances dites « émergentes » à la toxicité et aux effets environnementaux mal évalués, du type médicaments, hormones synthétiques, retardateurs de flammes etc…), qui sont régulièrement détectées et quantifiées dans la plupart des hydrosystèmes français d’eau douce via les résultats des réseaux de surveillance. A titre d'exemple, la France est le 1er pays européen en termes de Surface Agricole Utile (SAU) et serait avec une consommation annuelle de 30 214 tonnes (Ref 1 : Eurostat 2013), l’un des 2 plus grands consommateurs européens de pesticides juste derrière l'Espagne (31 832 tonnes), ce classement étant susceptible de s’inverser selon les années.

Les biocides sont utilisés partout, de l'agriculture aux collectivités publiques, aux opérateurs privés, aux jardiniers amateurs... Concernant l'agriculture, les cultures pérennes comme les vergers et les vignobles sont les plus grands consommateurs par unité de surface, en fonction du nombre élevé d’interventions pouvant atteindre une quinzaine, voire une vingtaine de traitements par an, et exercent de ce fait une pression importante sur les milieux naturels. Conséquence de cette pression polluante presque ubiquiste, selon le SOES (Réf. 2), en 2012, les pesticides ont été détectés sur 89 % des 2555 sites de surveillance concernant les cours d’eau, plus de 20 molécules en mélange ont pu être trouvées dans au moins 26% des sites, et 25% des sites dépassaient 0,5 µg/l de pesticides cumulés (plafond pour la potabilisation de l’eau brute sans pré-traitement). D’autres catégories de micropolluants toxiques constituent aussi un sérieux problème général, ayant conduit l'Union Européenne à adopter le règlement REACH en 2006 (Réf. 3) et à publier une liste des micropolluants interdits d'utilisation et (ou) à déclaration obligatoire de production ou d’utilisation au niveau Européen (Ref 4).

Cette liste a été régulièrement complétée et comprend actuellement 41 substances (nombre sans cesse en augmentation). L’ampleur environnementale de ces pollutions chimiques est bien illustrée par les données de surveillance des hydrosystèmes, qui sont à la fois un réceptacle naturel et une voie de circulation des flux polluants. D’après l’OIEAU, (Ref 5 : Eaufrance), pour l’année 2009, sur les 11 529 masses d'eau de surface des réseaux de surveillance français, 21% étaient classés en rouge (mauvais état chimique) et 34% étaient dans un état chimique encore indéterminé. Pour les eaux souterraines, sur les 574 masses d'eau de notre territoire, 41% sont classées rouge (mauvais état chimique).

Vu que les pesticides agricoles contribuent largement à ce constat, un premier programme national Ecophyto 2009 -2018 (Réf. 6) se fixait comme objectif une diminution de 50% de la consommation de pesticides, mais a fourni peu de résultats en termes de diminution de vente et de consommation jusqu'à présent. Une nouvelle initiative ECOPHYTO II (Ref. 7) a donc été mise en place fin 2015, qui met davantage l'accent sur l'agriculture biologique, l'agroécologie et d'autres méthodes de culture alternatives.

Un enjeu actuel important pour la durabilité des activités sociétales dans le respect de l’environnement est de mieux diagnostiquer et préserver la qualité des ressources naturelles. Au niveau de l’Union Européenne, la Directive Cadre sur l’Eau 2000/60/EC (Ref. 8) fixe un objectif de maintien ou de restauration de la qualité des eaux et des milieux aquatiques, sur la base des résultats des réseaux de surveillance institutionnels. Dans ce cadre, les diatomées benthiques sont l’un des compartiments biologiques-clés utilisés par les pays européens pour évaluer l’état écologique de leurs écosystèmes aquatiques.

En France, l’IBD, mis au point par l’équipe proposante d’Irstea en 1996 et qui a fait l’objet d’améliorations régulières depuis cette date (Ref. 9 : Coste et al, 2009) est l’outil indiciel diatomique de référence normalisé (Ref. 10 : AFNOR 2007) qui est utilisé en routine dans les réseaux de surveillance nationaux pour évaluer la qualité générale des cours d’eau.

Cette méthode biocénotique basée sur la composition spécifique des assemblages diatomiques diagnostique efficacement l’enrichissement ou l’altération générale des cours d’eau en liaison avec les activités humaines (eutrophisation, pollution organique, pollution chimique industrielle, etc…). Cependant, dans l’état, elle ne donne pas satisfaction pour diagnostiquer finement des effets de micropolluants toxiques. En effet, en fonction de la faible disponibilité de ce type de données à l’époque, elle n’a pas été calée sur les gradients de pollution toxique. De plus, selon le degré d’exposition in situ, des phénomènes d’adaptation peuvent se mettre en place (ex : Ref. 11 : Pesce et al, 2010), y compris sur des espèces réputées assez sensibles (ex : Ref. 12 : Roubeix et al, 2011 et Ref. 13 : Roubeix et al, 2012a), faisant perdre à la composition spécifique (espèces sensibles / vs tolérantes) une partie de son intérêt pour rendre fidèlement compte d’un niveau d’exposition toxique in situ.

Si la piste de mise au point d’une méthode de bio-indication d’impact toxique basée sur la composition biocénotique n’est pas complètement abandonnée, les approches écotoxicologiques constituent une voie a priori plus porteuse et plus pertinente à court ou moyen terme pour l’évaluation judicieuse d’effets toxiques. En effet, elles offrent l’intérêt d’aborder la spécificité des phénomènes toxiques à l’espèce chimique et à l’espèce biologique, elles présentent une plus grande sensibilité et précocité de diagnostic, elles peuvent permettre une mise en relation plus étroite cause-effet en fonction de la spécificité des cibles cellulaires ou génomiques visées, etc…Cependant, certains auteurs (par exemple, Ref. 14 : Carafa et al, 2010) soulignent qu’il reste un besoin important de développements méthodologiques de ce type sur certains éléments clés de la qualité biologique de la DCE (c’est en particulier le cas sur les diatomées benthiques des rivières, où les développements en matière de biomarqueurs moléculaires, notamment, sont très récents), afin que ces techniques puissent être utilisées en routine dans les réseaux de surveillance.

De nombreux travaux ont été conduits et publiés sur le développement de biomarqueurs et leur capacité à révéler des effets toxiques sur les organismes vivants de l'environnement, certains d'entre eux émanant des équipes de recherche impliquées dans le programme LIPID et dans l’encadrement de la présente thèse.

S’ilsbiomarqueurs permettent de diagnostiquer de façon relativement fiable l’existence d’une altération toxique par comparaison avec une modalité-témoin (ex : amont-aval d’un rejet ponctuel, tests écotoxicologiques de laboratoire) ou par comparaison avec une situation naturelle non-impactée (site de référence), certains d’entre eux étant considérés comme des biomarqueurs génériques de stress (ex : biomarqueur EROD sur poisson), d’autres étant considérés comme plus spécifiques de certaines catégories de toxiques, leur niveau de réponse reste cependant variable en fonction du matériel biologique et des conditions environnementales (ex : sexe, taille, saison par rapport au cycle reproducteur, gamme de températures …) et du niveau de principe toxique présent dans l’environnement.

Pour l’instant, ils sont donc surtout passés en application de routine via l’utilisation de tests standardisés en conditions contrôlées de laboratoire permettant d’évaluer le risque toxique lié à certaines substances.

Afin d’être utilisés dans les réseaux de surveillance de routine pour une évaluation générale d’état écologique rendant plus spécifiquement compte du stress toxique, il faudrait à terme qu’il puisse être proposé une batterie assez complète de biomarqueurs permettant de situer la nature de toute une gamme d’effets toxiques potentiellement rencontrés dans les milieux aquatiques, ainsi qu’un cadre interprétatif prédéfini et normalisé servant de base à la mise en place de marchés publics de prestations de surveillance avec le secteur privé, ce qui n’est pas encore le cas à l’heure actuelle. C’est notamment pour ces raisons que ces biomarqueurs ne sont pas encore suffisamment passés dans l’application routinière normée des réseaux de surveillance (diagnostic in situ dans les hydrosystèmes) et c’est dans ce sens qu’il serait très utile d’approfondir les travaux pour que leur utilisation puisse venir appuyer et enrichir l’Evaluation d’Etat Ecologique mise en place dans le cadre de la DCE.

En ce qui concerne les écosystèmes terrestres, le LBM a mis au point des méthodes permettant une évaluation sensible des effets de substances toxiques (ex : métaux lourds, micro-polluants organiques de synthèse du type produits chimiques industriels, pesticides, ...) dans les sols pollués, à partir de l’interprétation de la composition en acides gras des feuilles des plantes terrestres. En application de ce nouveau champ de connaissances, deux types de méthodes de diagnostic ont été testés avec succès et sont proposés à une application de routine :

1) Des essais de toxicité ex-situ réalisées avec une plante modèle (Lactuca sativa) cultivées en conditions contrôlées sur des échantillons de sols pollués en comparaison à un témoin. Ce test a été normalisé AFNOR-(Ref. 15 : NF-T standard X31 233, 2012, Ed AFNOR); voir aussi (Ref 16 : Le Guédard et al 2008) ;

2) L’analyse comparative de la composition en acides gras des feuilles de différentes espèces de plantes sauvages (par exemple Populus nigra, Lactuca seriola ...) directement échantillonnées dans les zones polluées (Ref 17: Le Guédard et al 2012a, Réf 18: Le Guédard et al 2012b, Ref 19: Le Guédard et Bessoule 2013). Ce test entre maintenant dans un processus de normalisation internationale ISO.

Compte-tenu de l’intérêt et de l’opérationnalité de ces résultats obtenus sur végétaux terrestres, une première approche exploratoire a été lancée en 2012 en collaboration entre le LBM et l'équipe CARMA d’Irstea, afin de tester si ce type de biomarqueur basé sur des profils lipidomiques de végétaux terrestres avait de bonnes chances d’être transférable sur le compartiment des diatomées des rivières.



Figure :Profils lipidiques obtenus lors d’une expérimentation exploratoire d’exposition de la diatomée Surirella angusta à l’Acétochlore (CARMA-LBM, 2012)

Les résultats préliminaires acquis sur l’espèce Surirella angusta (cf ci-dessus) ont montré une modification significative des profils d'acides gras après seulement 3 jours d'exposition à des concentrations réalistes d’acétochlore, les effets les plus évidents étant visibles sur des acides gras à longue chaîne intervenant dans les structures membranaires (diminution significative des C20 : 5, lipides de type Oméga 3).

Ce résultat n’est pas surprenant compte tenu du mode d’action connu de cette famille d’herbicides, les chloroacétanilides, qui perturbe les biosynthèses d’acides gras longues chaînes en liaison avec l’inhibition enzymatique des élongases. Ces premiers tests ont aussi permis d’observer un autre type de réponse significative au glyphosate, probablement basé sur la perturbation d’autres processus mais moins évident à interpréter d’emblée.

Ces résultats significatifs ont été obtenus alors que d’autres descripteurs généraux de toxicité classiquement employés pour traduire des effets sur la croissance végétale (par exemple biomasse, Chl.a, densité cellulaire...) n’étaient pas encore modifiés. Ces premiers résultats sont donc prometteurs en termes de chances de succès du transfert d’un tel biomarqueur, qui semble présenter le double intérêt de précocité et de sensibilité, et permettent aussi d’espérer une certaine spécificité de réponse de ce maillon diatomique à différentes catégories de substances toxiques.

S’agissant cette fois des écosystèmes aquatiques, l’examen des références scientifiques concernant l’évaluation des effets de la pollution toxique révèle que de nombreux biomarqueurs d'exposition ou d'impact toxique ont été testés et publiés depuis 20 ans, la plupart d’entre eux ayant été obtenus sur diverses espèces animales appartenant à des maillons biologiques-clés recommandés par la DCE (poissons, macro-invertébrés benthiques…).

Par ces approches, la détermination du niveau de transcription de gènes-clés impliqués dans des fonctions et voies métaboliques essentielles pour le fonctionnement cellulaire (biologie moléculaire transcriptomique) a largement démontré son intérêt pour évaluer les impacts moléculaires des micropolluants environnementaux.

Aussi, ce type d’approche a été utilisé avec succès pour évaluer les impacts toxiques des métaux lourds comme le cadmium ou le mercure, mais aussi de composés organiques tels que des molécules herbicides ou des HAP, sur plusieurs espèces de poissons-modèles (par exemple Ref 20 : Cambier et al, 2010 ; Ref 21 : Arini et al, 2015 ; Réf 22 : Dupuy et al, 2014), mais aussi sur bivalves d'eau douce Corbicula fluminea et Dreissena polymorpha (Ref 23 : Arini et al, 2014 ; Ref 24 : Santos et Martinez, 2014 ; Ref 25 : Châtel et al, 2014). Il convient de souligner que l'équipe EPOC-EA, qui participe au projet LIPID et à l’encadrement de la présente thèse, a été très impliquée dans ces nouveaux développements.
Cependant, beaucoup moins de travaux ont été publiés vis-à-vis du développement de biomarqueurs sur le compartiment végétal des hydrosystèmes. Même si les génomes complets de 4 diatomées marines (Thalassiosira pseudonana, Phaeodactylum tricornutum, Pseudo-nitzschia multiseries et Fragilariopsis cylindrus) ont pu être séquencés ces dernières années (Ref 26 : JGI genome Portal), à notre connaissance, jusqu’à un passé très récent, aucun travail publié n’avait conduit au développement opérationnel de biomarqueurs d’effets toxiques sur les diatomées benthiques d'eau douce.

Une difficulté méthodologique pour l'extraction des ARN, qui nécessitait une rupture ménagée des parois des frustules siliceux en respectant le contenu intracellulaire, a été résolue par Kim-Tiam et al, 2012 (Ref 27). Une fois cette étape préalable maîtrisée et dans le cadre du même travail, une approche transcriptomique s’appuyant sur l'ARN total a permis à cette équipe EPOC-EA, d'identifier 9 gènes d'intérêt pour la détection des effets toxiques d'un métal lourd (Cd) sur l'espèce Eolimna minima, et de conforter le repérage de ces gènes sur d’autres espèces d'eau douce en culture. Puis, dans le cadre partenarial inter-équipes EA-CARMA, Moisset et al, 2015 (Ref. 28) ont utilisé avec succès ces gènes pour évaluer la toxicité du diuron (herbicide, famille des urées substituées) sur 3 espèces de diatomées de cours d’eau.

D'autres descripteurs plus généraux de toxicité ont été utilisés sur les diatomées d'eau douce depuis les années 1995 jusqu’à maintenant, afin d'évaluer les gradients de pollution toxiques, de démontrer des effets in situ et en laboratoire, d’évaluer des dispositifs de remédiation des cours d'eau pollués... (voir en Réf. 29, la large revue de Morin et al 2016).

Selon le cas, les descripteurs utilisés étaient des paramètres structuraux (taille et/ou biovolumes des cellules), des descripteurs de croissance (matière sèche des biofilms, quantité de chlorophylle a produite…), la composition des communautés, le nombre de frustules portant des déformations tératologiques etc...

Les produits toxiques abordés ont principalement été : 1) des métaux lourds (par exemple, Ref 30 : Gold et al, 2002 ; Ref 31 :Gold et al, 2003 ; Ref 32 : Feurtet-Mazel et al, 2003 ; Ref. 33 : Morin et al, 2008 ; Ref 34 : Duong et al, 2010 ; Ref 35 et 36 : Arini et al, 2012a et 2012b ; Réf. 37 : Herlory et al, 2013, sur le cas spécifique des radionucléides ...); 2) des pesticides (par exemple Ref 38 : Peres et al, 1997; Ref 39 : Duong et al, 2006; Réf. 40 : Duong et al, 2007; Ref 41 : Debenest et al, 2009; Ref 42 : Morin et al, 2009; Ref 43 : Roubeix et al, 2011a; Ref 44 : Roubeix et al, 2011b, ...). Plus récemment, les biomarqueurs fonctionnels ont aussi pu être testés avec succès et utilisés, par exemple des changements dans les activités enzymatiques antioxydantes (Ref 45 : Bonnineau et al, 2013; Ref 46: Kim-Tiam et al, 2015a)., sur l'efficacité photosynthétique et les taux de transfert d'électrons dans les photosystèmes (Ref 47 : Kim Tiam et al., 2015b)...

Un bon nombre des travaux pré-cités (cf références soulignées de la liste de références plus complètes, consultable à partir de la page 15 du présent document) ont été produits par des équipes du consortium LIPID et attestent de leur expérience en ce domaine, les rendant tout-à-fait aptes à réaliser le programme proposé et à encadrer avec succès la présente thèse.

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