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Mai 2005 n°228

Une version plus complète de ce bulletin est accessible sur le site de l'INRA www.inra.fr. sous son nom dans : Information Scientifique et Technique puis Publications INRA en ligne.

Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires additionnels consultables dans la version électronique. André BERKALOFF

e-mail : andre.berkaloff@igmors.u-psud.fr

Concepts et Techniques

1.*** La notion de riborégulateurs (petits ARNs intervenant sur l'expression génique,de façon allostérique en présence d'un ligand) se développe. On est même, entrain d'en construire sur mesure TS Bayer et al.; Nature Biotechnology23 (MAR05) 337-343), voir également le commentaire de FJ Isaacset al.; p.306-307.

Les aptamères sont des acides nucléiques, liantspécifiquement certains ligands(protéines, colorants, antibiotiques, etc…), et que l'on sélectionne aprèsévolution in vitro. Ces aptamères peuvent conférer des compétencesallostériques régulatrices à d'autresARNs comme les ribozymes.

Les auteurs,travaillant chez Saccharomyces cerevisiae, en décrivent un type appelé "antiswitches". Ils sont modulaires et modulables.

Ils ont construit des riborégulateurs porteurs d'un domaine antisens destiné à bloquer la traduction d'un messager défini,et qui est démasqué après interaction avec leur ligand spécifique. Le démasquage (et donc l'inhibition de l'expression) est permis parl'existence d'un segment, également apparié reconnu par le ligand qui sedéploie alors et démasquel'antisens. L'astuce consiste à rendre la partiedouble-brin contenant l'antisens un peu plus stable que celle contenant le site liant le ligand.

En fait les auteursdécrivent deux régulateurs aux fonctions opposées un "off-antiswitch" (celui décrit plus haut) et un "on-antiswitch". Ce dernier comporte un antisenslibre et, en présence de théophyllinecette séquence est engagée dans un double-brin et donc masquée.

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2.*** EA Davidson et al.; Trends in Biotechnology23 (MAR05) 109-112, discutent despossibilités de manipuler les ARNsrégulateurs. On en connaît de nombreusesformes naturelles chez les bactéries et cela a donné des idées ailleurs pour ensynthétiser des formes artificielles. Les ARNs ont l'avantage de pouvoiracquérir plusieurs conformations que l'on peut utiliser. Ces petits ARNspeuvent être utilisés sous formes d'aptamères associés à leurs ligands spécifiques, ou sous formes de ribozymes (aptazymes) ousous les deux formes à la fois. La simplicité de la manipulation del'efficacité des ARNs permet de rêver.

L'article est basé sur une publication de FJ Isaacset al.; Nature Biotechnology 22 (JUL04) 841–847 montrant qu'on peut faciliter la traduction d'un messageren liant la partie amont (5') non traduite à un petit ARN qui libère le sited'initiation de la traduction pour les ribosomes.

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3. JS Parker et al.; Nature 424 (31MAR05) 663-666 et JB Ma et al.; p.666-670 décrivent parallèlement la structure qui permet la reconnaissance, puis le clivage du messager par le complexe Argonaute–siRNA (ARN qui assure la reconnaissance). Les protéines Argonaute portent un domaine PAZ (PIWI/Argonaute/Zwille) N-terminal et PIWI C-terminal. Les auteurs ont utilisé une protéine PIWI d'Archaeoglobus fulgidus associé au siRNA dont la partie amont (5', phosphorylée) permet la reconnaissance de la cible. Le premier nucléotide n'est pas engagé dans l'appariement avec la cible mais le groupement phosphate 5', indispensable et logé dans une poche basique du domaine PIWI, est associé à une tyrosine de cette poche, tandis que les quatre suivants participent à l'appariement. La structure permet, ainsi de placer à la distance convenable le site de fixation du complexe RISC et celui du clivage du messager cible par ce complexe.

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4. SS David; Nature 424 (31MAR05)569-570 discute l'article de A Banerjee et al.; p.612–618qui apporte des éclaircissement sur une énigme : comment s'y prend la cellulepour détecter des anomalies des nucléotides à réparer dans l'ADN. Il s'agit dela 8-oxoguanine glycosylase qui repère et élimine les8-oxoguanines (oxoG) qui sont une altération de la guanine. Lastructure de l'enzyme a été établie par les auteurs.

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5. L'application de l'interférence (RNAi) continue à révélerdes fonctions géniques inconnuesjusqu'à présent, même chez Caenorhabditis elegans, où le mécanisme a été découvert. SM O’Rourke et al.; Nature 434 (24MAR05) 444-445. La méthode a été généralisée à Saccharomycescerevisiae, où tous les gènes ontainsi été inactivés. Le résultat était relativement surprenant, seuls 19% desgènes sont indispensables aux fonctions essentielles.

B Sönnichsenet al.; p.462–469 reviennent à Caenorhabditis elegans avec lamême technique. On avait pu identifier par diverses techniques que, sur le total de 19 282 gènes identifiés dans le génome complet, seuls 1 668 gènes contribuent à un phénotypevisible. Un nombre plus réduit (661) de ces gènes se révèlent indispensables aux deux premières divisions embryonnaires, par exemple, mais les phénotypes étaient, généralementgroupés par très grandes catégories comme "létal embryonnaire", etc….B Sönnichsen et al.ont raffinécette description en se basant sur les effets de l'injection d'ARNs duplexescouvrant 98% des gènes. Les résultats sont plus abondants que ceux que l'onavait obtenu par la technique élégante de la fourniture de ces ARNs expriméspar les bactéries dont le ver se nourrit (1266 gènes contre 929). Ces auteursse sont concentrés sur les gènes de létalité embryonnaire précoce endétaillant, à l'échelle cellulaire, les effets perceptibles d'une inactivationpar interférence ARN (voir leur sitetrès simple d'emploi: www.worm.mpi-cbg.de/phenobank2).

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6 J Brennecke et al.; Public Library ofScience Biology 3 (MAR05) e85 discutent desmécanismes de reconnaissance des cibles par les microRNAs (miRNAs),petits ARNs régulateurs très nombreux chez les animaux et les plantes. Lesauteurs examinent systématiquement les exigences de l'appariement entre le miRNA et la cible. Même si onne connaît pas la fonction d'un miRNA, on peut prédire sa cible, toutparticulièrement chez les plantes où l'appariement est presque complet. Chezles animaux l'appariement est en général relativement court et discontinu. Celapose des problèmes si on veut pratiquer une recherche systématique des cibles.C'est ce qui justifie l'approche du groupe de l'EMBL à Heidelberg.

En réalité, chaque miRNAs a une centainede cibles potentielles. On savait déjà plus ou moins que l'appariement dela partie 5' du miRNA est importante Les auteurs distinguentles cibles à sites "5'dominants" s'appariant bien à lapartie 5' du miRNA, alors qu'on observe une grande diversité d'appariements àla partie 3', avec deuxsous-ensembles, un sous-ensemble canonique s'appariant bien aux deux extrémités et des "sites amorces" avec un faible appariement en 3'. Le deuxième sous-ensemble, celui des sites de la cible"3' compensatoires" présenteun appariement très imparfait en 5' quiest compensé par un très fortappariement en 5'. Tous ces types jouentun rôle, et les "3' compensatoires" servent à discriminerentre les miRNA d'une même famille. L'évaluation des niveaux d'appariement en 3' indique queles sites amorces sont les plus nombreux et ont généralement été"manqués" lors des criblages exhaustifs.

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7. *** On trouvera dans J Rosenblatt; NatureCell Biology 7 (MAR05) 219-222, une revue sur les mécanismesqui permettent les déplacementscoordonnés des asters qui vont lesloger aux deux pôles de la cellule après la rupture de la poche périnucléaire,lors d'une mitose.

Il existe deux mécanismes, utilisés séparémentou conjointement, selon le type cellulaire. Une fois les asters en place,certains microtubules des asters vont se fixer sur les chromosomes et vont lesaligner sur la plaque métaphasique.

Les cellules dépourvues de centrosomes sedébrouillent autrement, en amorçant le fuseau depuis les chromosomes vers lespôles.

Il faut que ce positionnement soit assuré aussibien dans le cas d'une division symétrique que dans celles qui sontasymétriques. C'est donc, dans ce cas, la position globale du fuseau qui est enjeu.

Dans le cas de la présence d'asterson constate que l'enveloppe nucléaire sert de guide, mais elle disparaît à desstades différents selon les systèmes cellulaires (elle est très tardive chezles cellules embryonnaires initiales de Caenorhabditis elegans et Drosophila etabsente dans le cas de la levure).

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8.*** M Muratani etal.; Cell 120 (25MAR05) 887-899 montrentque l'activateur de transcription bien connu Gal4doit être ubiquitinylé (et détruit viale protéasome) pour donner lieu à l'activation. Cette modification estnécessaire à un stade post-initiationde la transcription pour une obtention de messagers fonctionnels. Voirégalement le commentaire de K Arndt et al.; p.733-737.

M Muratani et al. confirment qu'il existe trois isoformes de Gal4 phosphorylées différemment (Gal4a, Gal4b et Gal4c) et que la forme Gal4c est la forme active en présence de galactose. Sa phosphorylation est la conséquence de l'activation. En l'absence d'induction, Gal4a et Gal4b, instables, ont une demi-vie de l'ordre de20 minutes. Cette instabilité est liée à l'activité d'une ubiquitine ligase,Grr1. En galactose (inducteur), Gal4a et Gal4b deviennent stables, tandis queGal4c est instable sous l'effet d'une autre ubiquitine ligase, Dsg1 (alias Mdm30). En l'absence de Dsg1, les gènes cibles de Gal4 sont transcrits, mais leurs messagers ne sont pas traduits. Le niveau de phosphorylation du domaine C-terminal de Pol-II (CTD) est déprimé auniveau de deux sérines cibles. Comme la phosphorylation de CTD permet le recrutement de plusieurs co-facteursintervenant dans la maturation des messagers cela est vraisemblablement lepoint d'impact de Gal4. Mais le fait que GAL4 puisse être détruit, ce qui n'estquand même pas certain, obligerait à admettre que chaque cycle d'élongationimplique une élimination du complexe associé et son renouvellement. Ce n'estvraiment pas économique. De l'article et du commentaire, on peut déduire qu'ily a là un problème intéressant, mais dont la solution est encore peu claire.

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Les Productions Végétales

Les gènes etles génomes

9. J Yu et al.;Public Library of Science 3 (FEB05) e38analysent de nouvelles versions génomiques shotgun des rizindicaet japonica avec une résolution très supérieure à celle des versions de 2002, et les comparent. Ilsont aligné 97,7% des gènes. Ils estiment à 38 000-40 000 le nombre des gènes.Le contenu en gène est très peu variable et ce sont les régions intergéniquesqui sont extrêmement variables. Ce qui est intéressant est que l'on retrouvedes traces de deux duplications successives, une étant ancienne et une autre, plus récente, aporté sur les chromosomes 11 et 12, tandis que des duplications de gènesindividuels est massivement en cours, comme chez toutes les Graminées.

Les auteurs font le point, dans leurintroduction des diverses versions de ce génome par le Beijing Institute ofGenomics, Syngenta, International Rice Genome Sequencing Project (IRGSP) etMonsanto, avec les particularités techniques de chacune.

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Latransformation des Plantes

10. MD Chilton (de Syngenta) Nature Biotechnology 23(MAR05) 309-310 évoque la publication de W Broothaertset al.; Nature 433 (10FEB05) 629-633 qui ont décrit une transformation desplantes par diverses Rhizobiacées modifiées. Elles sont encore peu efficaces, mais permettent de tourner les brevetssur Agrobacterium et il n'est pas étonnant que cette découverte, utilisableen "open source", ait été faite au Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriculture (CAMBIA) de Charles Sturt University à Canberra.

Le transfert des plasmides Ti dans d'autres bactéries a étélongtemps infructueux (notamment chez Escherichia coli et Pseudomonasaeruginosa mais a donné des indicesencourageants chez les Rhizobiacées comme Rhizobium trifolii,Rhizobium leguminosarum et Phyllobacteriummyrsinacearum. Plus les bactériessont proches d'Agrobacterium, plus le succès semble assuré. De là àles appeler toutes Agrobacterium, il y a un pas difficile àfranchir pour des raisons de continuité historique et de propriété industrielledont on veut, ici, s'affranchir.

Le système detransfert basé sur Ti est fonctionnel chez Rhizobium spp. NGR234 (un nodulateur très peu spécifique et trèsprobablement un Agrobacterium commel'admettent les auteurs, donc pratiquement à problème), Sinorhizobium meliloti (un nodulateur de la Luzerne) et Mesorhizobiumloti.

Les auteurs ont obtenuplusieurs tabacs (avec les trois bactéries), un riz, et quelques Arabidopsis thaliana transformés avec Sinorhizobium (seule donnée des auteurs). L'efficacité est encore modeste car, dans le cas leplus favorable du tabac elles de 1 à 20% de celle d'Agrobacteriumtumefaciens (en se basant sur l'expressiondu transgène marqueur).

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L'expression génique

11. L'interférence ARN(RNAi) au niveau de la transcriptionimplique une transcription à basniveau du gène réprimé. Il estvraisemblable que cette expression limitée est nécessaire à la répression. Ilexiste, dans ce but et chez les plantes,une polymérase spéciale, la polyméraseIV, qui assure la RNAi de l'hétérochromatine, mais n'est pas indispensable à la survie cellulaire. L'inactivationdes gènes des sous-unités NRPD1 ou NRPD2 de Pol-IV inhibe la formation del'hétérochromatine au niveau des chromocentres liée à la non-méthylation descytosines des gènes péricentromériques et de rétroéléments (Y Onoderaet al.; Cell 120, (11MAR05) 513–622). Pol-IVréprime l'expression de certains transposons et des ADNs répétitifs par unmécanisme du type siRNAs impliquant la RNA polymérase 2 ARN-dépendante (RRP2)et la RNase Dicer-like 3 qui donne les siRNAs. (AJ Herret al.; Science 308(01APR05) 118-120).

Ces siRNAs guide une méthylation de l'ADN et la modification des histones, rendant le gène cible hétérochromatique.

Pol IVet la RdRP2 interviennent probablementen tandem pour engendrer des ARNs doubles brins (dsRNAs) transmissibles mitotiquement et qui sont clivés pour donner les siRNAs assurant l'hétérochromatinisation. Ces observations expliquentl'accroissement de la transcription primaire en l'absence de Pol-IV, plutôt quesa réduction, le silencing ADN étant perdu. Finalement, et comme le fontremarquer MW Vaughan et al.; Molecular Cell 17 (18MAR05) 754-756, l'ARN a gardé son statut de matériel génétique, au moinsdans le cas de l'hétérochromatine en réprimant l'ADN. Cette découverteest bien un acquis très intéressant dans le domaine de l'épigénétique. On peutse demander si cela pourrait avoir un rapport avec ces énigmatiques ARNréparateurs évoqués dans le Bulletin d'Avril §1.

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13.Des chercheurs de Monsanto (et issus de Calgene,maintenant filiale de Monsanto) découvrent maintenant que les résultatsqu'ils avaient obtenus entre 1988 et 1992sur la répression par antisens du gène de polygalacturonase (rendant les tomates plus fermes) pourraient bien avoirété, en réalité, des manifestations d'interférence ARN (RA Sanders et al.; Nature Biotechnology 23(MAR05) 287). Comme quoi un brevet peutcouvrir une explication erronée, mais reste valable par ses effets.

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Ledéveloppement

14.*** L'interdigitation des cellules foliaires intéresse les chercheurs en cancérologie. L'interdigitation des cellules épidermiques est liée àune croissance localisée d'une cellule coordonnée avec une inhibition de lacellule voisine à ce niveau. J Settleman; Cell 120 (11MAR05) 570-572 discute de l'article de Y Fu et al.; p.687–700 qui décrit une organisation différentielle ducytosquelette assurant cette interdigitation chez Arabidopsis. Cette coordination repose sur deux Rho GTPases (ROP2 et ROP4), quiinterviennent probablement chez les animaux aussi bien que chez les plantes.

Les microtubules concentrés dans les indentations et organisés en faisceauxtransversaux restreignent l'élargissement du col, tandis que les microfilaments d'actine du cortex des lobes sont associés à leur élargissement. Il n'est donc pas étonnant que les GTPases Rho qui régulent, entre autres, l'organisation ducytosquelette, soient impliquées dans le tout.

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15. Le gène Decreased apical dominance1(Dad1)/PhCCD8 de Petunia hybrida code, une dioxygénase clivant les caroténoïdes(CCD), orthologue du gène MORE AXILLARY GROWTH4 (MAX4)/AtCCD8 d'Arabidopsis. Ilintervient manifestement sur le développement des méristèmes axillaires de la tige (sourcedes ramifications), ainsi que dans d'autres aspects du développement. Il semble donc que cette dioxygénase ait pour cible ces fameuses substances encore inconnuescirculantes dans la plante. KC Snowden et al.; The Plant Cell 17(MAR05) 746-759.

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16. Le méristème apicalcaulinaire est déterminé grâce à deuxvoies complémentaires celle de SHOOT MERISTEMLESS (STM) qui définit l'ensemble de la région méristématique au sein de la quelle la voie WUSCHEL (WUS) détermine les cellules méristématiques proprement dites, et qui est rétrorégulée par le produitdes gènes CLAVATA.

On ne connaissait que peude chose sur la croissance de ce méristème une fois déterminé. X Wu etal.; Current Biology 15 (08MAR05) 436-440montrent que le gène à homéobox STIMP(alias WOX9) d'Arabidopsis intervient dans la croissance des méristèmes etleur maintien.

Le gène STIMPY régule la croissance du méristème en agissant positivementsur l'expression de WUS. STIPintervientégalement dans le reste de la partie aérienne de la plante et dans la racine.Ce qui est intéressant est que l'additionde saccharose permet de compenser les mutations stip en relançant lecycle cellulaire (et donc en empêchant la différenciation).

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17.*** Des cellules souches sont maintenues aucentre des méristèmes et ces cellules donnent régulièrement des précurseurs,placées à la périphérie initiant la formation de nouveaux organes. On commenceà connaître les signaux intercellulaires échangés, permettant le maintien de lastructure du méristème en ajustant l'expressiongénique selon la position respective descellules . Une revue de MM Castellanoet al.; Current Opinion in Plant Biology 8 (FEB05) 26-31 discute de ces signaux. Ils discutent également comment lepositionnement des primordia des organes est assuré, et comment le méristème influence la polarité des organes. Commeon l'a montré chez les plantes et les animaux, dès qu'une cellule est déplacéehors du champ d'action du méristème, elle commence à se différencier.

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La Physiologie des Plantes

19.*** Les gradients d'auxine dont on parle depuis fort longtemps supposent un transport à partir de sources. Les flux engendrés par le fonctionnement des transporteurs d'efflux d'auxine dans la racine, autour du centre quiescent avec unflux acropète dans la zone vasculaire de la stèle et un retour basipète parl'épiderme dans toute la région méristématique avec une nouvelle boucle auniveau de la transition entre zone méristématique et zone d'élongation sontanalysés dans S Kepinski et al.; Current Biology 15 (29MAR05) R208-R210à propos de l'article du groupe de B Scheres (I Blilou et al.; Nature 433, (06JAN) 39–44 également évoqué dans IA Paponovet al.; Trends in Plant Science 10 (APR05) 170-177 qui fait le tour des facilitateurs d'efflux de l'auxine chezles mono- et dicotylédones. Ce double flux est important pour la régulation del'expansion cellulaire. L'article montre l'existence d'un réseau detransporteurs recyclant l'auxine autour de la pointe racinaire avec la familledes facilitateurs PIN.

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20.HFR1 (aliasREP1 ou RSF1) est connu comme un régulateur positif du signal phytochrome A, intervenant donc dans la transmission du signal du rougelointain. C'est un facteur de transcription atypique de 292 acides aminés. Il n'est actif que dans une partiedes réponses au PhyA. J Yang et al.; The Plant Cell 17 (MAR05) 804-821 montrent que HFR1 est une protéine à vie courte à l'obscurité etqu'elle est dégradée via le protéasome.La lumière, quelle que soit sa qualité spectrale, stimuleson accumulation en la stabilisant. Les auteurs montrent également que HFR1 selie physiquement à COP-1 (Constitutive Photomorphogenesis-1) et que COP1 joue le rôle d'ubiquitineligase vis à vis d'HFR1 in vitro etqu'elle est nécessaire à la dégradation d'HFR1 in vivo. Les plantes surexprimant les 161 aminoacides C-terminauxprésentent une photomorphogenèse accentuée. Cette forme tronquée est plus stable àl'obscurité, indiquant que la
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