I. Introduction





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Simonnet Jean Chateigner Aurélien



Travaux pratiques d’immunologie

Fragmentation des immunoglobulines

Immunotransfert

Test Elisa

Professeur : Mr Erard

I.Introduction


A travers ce TP, nous allons réaliser différentes manipulations, qui seront plus ou moins liées : la fragmentation des Ig, un Immunotransfert et un test ELISA.

Le clivage ou la fragmentation des Immunoglobulines permet d’étudier les différentes régions d’une Ig (immunoglobuline). La digestion est obtenue en utilisant des enzymes protéolytiques qui clivent l’Ig au niveau de régions bien distinctes. On obtient des fragments : Fab par la papaïne, (Fab’)2 par la pepsine et le fragment Fc par les deux enzymes. La papaïne est capable de cliver les IgG de toutes les espèces animales.

immunoglobinafterdigests.jpg

Par électrophorèse, on pourra observer l’effet des digestions enzymatiques sur la taille des fragments obtenus en comparant avec de l’Ig non fragmentée.

L’immunoblot, ou immunotransfert (western blot), est une technique dont le but est de repérer spécifiquement une protéine ayant préalablement été « purifiée » en une bande sur un gel après électrophorèse, puis transférée sur une membrane PVDL (technique western blot). Pour détecter cette protéine, on utilise un anticorps dit « primaire » qui va se fixer spécifiquement sur la protéine en question. Ici celui-ci sera dirigé contre la SAB (sérum albumine bovine). On révèle ensuite le complexe anticorps-SAB par un anticorps dit « secondaire », qui lui va reconnaitre spécifiquement l’anticorps primaire.

Dans cette expérience, on utilise comme anticorps primaire, un anticorps de lapin : on a injecté la SAB à un lapin, ce qui a stimulé son système immunitaire qui s’est mis à synthétiser des anticorps dirigés contre des déterminants antigéniques (épitopes) de la SAB. Plusieurs immunisations sont nécessaires (système de rappel). On pourra prélever ensuite le sang du lapin, le laisser coaguler, et en récupérer le sérum. On est donc en présence d’un sérum de lapin anti-SAB : c’est ce qu’on utilise dans cette expérience.

L’anticorps secondaire est obtenu par immunisation de chèvre contre l’anticorps de lapin anti SAB, selon un protocole similaire. On y couple ensuite la phosphatase alcaline qui permettra la révélation.

L’ELISA est une technique immunologique très employée en médecine, est utilisée pour détecter le titre d’un anticorps pour un antigène donné et donc d’évaluer son affinité relative. On peut également étudier les homologies et les interactions entre différents antigènes.

On étudie ici la réactivité du sérum polyclonal de lapin anti-SAB vis-à-vis de la SAB et de L’OVA (Ovalbumine). Notre but dans ce TP est de voir s’il est possible de doser de la SAB avec un anticorps anti-SAB et de tester la spécificité de l’anticorps, en regardant si celui-ci reconnait l’ovalbumine.

Ces manipulations ont pour but d’étudier certaines techniques immunologiques, de comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans chacune, d’en tirer l’intérêt et de possibles applications et de comprendre alors la puissance de cette science qui est aujourd’hui en pleine expansion.

II.Matériel et méthode

A.Fragmentation des Ig


Les immunoglobulines utilisées sont issus d’un sérum de lapin. On réalise une digestion, à 37°C, pendant 30 minutes et pendant 1h30, pour montrer l’efficacité de la réaction en fonction du temps.

Digestion à la Papaine : Les Ig sont placées à 2mg/mL dans un tampon de digestion (PBS, 0,02M EDTA, 0,02 cystéine). On en place 50µl dans 4 tubes Eppendorf. Dans les tubes 1 et 2, on met du PBS, dans les tube 3 et 4, on place de la solution enzymatique. Les tubes 1, 2 et 3 sont incubés pendant 30 minutes puis la réaction est arrêtée avec de l’iodoacétamine. En fait, celui-ci sert seulement dans le tube 3, mais on en met dans les tubes 1 et 2 pour avoir des solutions comportant les mêmes composés : ceci évite des variations non significatives des résultats. Le tube 4 est incubé 1h30, puis la réaction est aussi arrêtée par de l’iodoacétamine.

Digestion à la Pepsine : Cette expérience fut réalisée par l’autre groupe selon un protocole similaire, le but recherché étant le même, c'est-à-dire une digestion de l’immunoglobuline par l’enzyme. On note cependant que l’on réalise la réaction à pH = 4. La pepsine possède une activité optimale à pH = 2. Cependant, l’immunoglobuline ne supporte pas ce pH. On travaille donc à pH = 4, supporté par la protéine et permettant une activité enzymatique assez importante pour une coupure de l’Ig.

Purification : Les solutions sont ensuite dialysées toute la nuit, à 4°C, contre du PBS. Ceci permet une purification partielle de l’Immunoglobuline (ou des différents fragments de l’Ig).

On prépare ensuite le gel d’acrylamide-Bisacrylamide utilisé pour la migration. Celui-ci comporte 2 parties, le gel de concentration et le gel de séparation. Le gel de concentration permet une migration rapide et une concentration des composés de chaque solution à l’interface entre les deux gels, ce qui permet à tous les composés de commencer leur migration depuis le même point. Le gel est en suite placé dans la cuve d’électrophorèse comportant le tampon adéquat.

Chaque échantillon est mis dans un tampon de charge, appelé Laemmli. Celui-ci possède une densité importante, ce qui facilite le dépôt, étant donné que l’on dépose l’échantillon dans les puits du gel immergé dans le tampon. Le Bleu de bromophénol qu’il contient est un composé de bas poids moléculaire qui migre très vite et qui permet donc de suivre le front de migration. Le SDS (sodium dodécyl sulfate) confère, aux molécules de la solution, la même charge, en entourant celles-ci d’un manteau négatif, les protéines ne migrent alors que selon leur taille.

On utilise deux tampons de charge différents : un tampon réducteur (avec du β-mercaptoéthanol) pour le tube 2 et un non réducteur pour les tubes 1, 3 et 4. Après mélange du tampon de charge et des solutions, on place les tubes à 95°C pendant 5 minutes, pour une bonne répartition du SDS (grâce à l’agitation), et une réduction des ponts disulfures des Ig par le β-mercaptoéthanol dans le tube 2. On dépose ensuite les échantillons dans les puits ainsi qu’un témoin de masse (TM).

On réalise également les dépôts suivants, selon le même protocole (tampon de charge non réducteur + chauffage), sur même gel : TM, Ig, Sérum Albumine bovine, ovalbumine. Ces dépôts serviront au western blot (expérience décrite plus loin). Voici l’allure des dépôts du gel.


Figure : gel SDS-Page.

1 : Ig réduit et digéré à la papaïne 1h30

2 : OVA

3 : SAB

4 : Ig non réduit

TM : témoin de masse

5 : Ig réduit et digéré à la papaïne 1h30

6 : Ig réduit et digéré à la papaïne pendant 30 minutes

7 : Ig réduit

8 : Ig non réduit.
1

2

3

4

TM

5

6

7

8

TM

Stacking gel : gel de concentration

Running gel : gel de migration

On surveille la migration : quand le bleu de bromophénol (situé au niveau du front de migration) arrive à la limite du gel, on stoppe la migration.

On coupe le gel en deux, laissant pour l’instant de coté la partie qui servira pour le western blot. On colore la première partie du gel avec du bleu de Coomassie. Celui-ci se fixe de façon aspécifique sur toutes les protéines. C’est un colorant souvent utilisé pour ce genre de manipulations. On rince le gel à l’eau distillé puis on passe au microonde pour enlever le surplus de colorant et alors révéler les différentes bandes sur le gel.
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