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Juillet 2005 n°230

Une version plus complète de ce bulletin est accessible sur le site de l'INRA www.inra.fr. sous son nom dans : Information Scientifique et Technique puis Publications INRA en ligne.

Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires additionnels consultables dans la version électronique. André BERKALOFF

e-mail : andre.berkaloff@igmors.u-psud.fr

Concepts et Techniques

1. Les cellules souches sont des populations cellulaires qui continuent à se diviser alors que leurs descendantes s'arrêtent, pour la plupart de le faire pour se différencier. SD Hatfield et al.; Nature 435 (16JUN05) 974-979 montrent, chez la Drosophile, que la division des cellules souches est régulée par des miRNAs. Les mutants de la RNAse Dicer, qui découpe les ARNs doubles brins pour donner les miRNAs, présentent des cellules souches germinales avec un délai dans la transition entre les phases G1 à S dans le cycle cellulaire. Cette transition dépend de l'inhibiteur Dacapo des Cdk (Cyclin-dependent kinase).

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2. ### Les études génétiques classiques montraient que l'aneuploïdie a des effets plus sensibles qu'une polyploïdie. Ces perturbations sont causées par des déséquilibres dans les régulations des gènes dont le dosage est perturbé, mécanismes dont les composants sont distribués sur tous les chromosomes. De la sorte l'évolution dépend plus des régulations, faciles à perturber, que des gènes "de ménage" ordinaires.

JA Birchler et al.; Trends in Genetics 21 (APR05) 219-226 analysent la contribution de ce phénomène aux régulations des QTLs (Quantitative Trait Loci), à la vigueur hybride, à l'évolution des génomes et à la spéciation post-zygotique.

L'hétérosis a toujours été un mécanisme fascinant, mais on n'en a guère d'explications générales. L'idée qu'il y a une complémentation entre allèles légèrement défavorables a été avancée; ceci existe bien, mais il y a probablement d'autres explications. On peut invoquer un dosage d'allèles, ce qui s'explique chez les polyploïdes résultant d'une hybridation suivie d'un doublement chromosomique (l'hétérosis progressive avec ajouts successifs de garnitures chromosomiques est un argument), mais ceci est difficile à expliquer pour des diploïdes.

On a récemment mis en évidence un autre mécanisme révélé par la non additivité de l'expression des deux allèles parentaux chez les hybrides. On peut attendre que la contribution des deux allèles donne lieu à un niveau d'expression intermédiaire entre eux. Cela est généralement vrai, mais pas toujours. C'est le cas pour le Maïs et la Drosophile. On l'a également observé dans de nouveaux allotétraploïdes du Cotonnier, ou l'expression ne respecte pas cette règle et que, de plus, le niveau d'expression varie d'un tissu à un autre. Cette non additivité a été analysée chez des maïs diploïdes et triploïdes. Il y a symétrie des croisements pour les hybrides diploïdes, mais pas pour les triploïdes où on introduit une dissymétrie (AAB contre ABB par exemple) du dosage génique. Des régulations homoalléliques sont probablement plus efficaces que celles qui sont hétéroalléliques.

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3. MEJ Woolhouse et al.; Trends in Ecology & Evolution 20 (MAY05) 238-244 se préoccupent de l'évolution des pathogènes émergents (c'est à dire des sauts d'espèces hôtes). La génétique des populations qui sous-tend cette évolution et l'épidémiologie résultante est l'objet de cette revue. On trouve des traces de ces sauts d'espèces quand on compare les arbres phylogéniques des hôtes et des pathogènes et qu'on y découvre des incohérences. Les auteurs montrent que si la prédiction de ces sauts évolutifs est impossible, on peut dégager des caractéristiques communes. On a pu le montrer pour de nombreux virus. Les virus à ARN sont évidemment ceux qui ont une propension particulière à passer d'un hôte à un autre, notamment d'un réservoir naturel à une espèce pour laquelle nous sommes plus concernés, ne serait-ce que parce qu'ils sont dépourvus de systèmes de vérification des produits de la réplication du génome. Ces sauts existent pour des pathogènes végétaux comme les Phytophtora. Le saut d'une espèce à une autre n'est pas toujours dramatique, mais plusieurs des pandémies actuelles ont une origine de ce type, encore faudrait-il montrer que ce n'est pas la capacité de dissémination, indépendante du pathogène, énormément accrue ces derniers temps qui est responsable permettant d'atteindre les populations sensibles difficilement accessibles auparavant (pourtant voir la peste noire médiévale partie de Marseille du fait de la cupidité commerciale). Mais ceci n'est pas un élément suffisant. Des pathogènes comme le virus de la rage a depuis longtemps acquis une capacité à passer à l'homme sans créer pour autant d'épidémies dévastatrices.

La dissémination d'un pathogène dépend de la capacité d'amplification de son génome dans le nouvel hôte: si elle est inférieure à 1 (R0<1) des infections répétées à partir du réservoir naturel ne conduiront pas à une épidémie généralisée. C'est le cas du virus Ebola malgré sa très grande pathogénicité pour l'homme. Ce n'est pas le cas pour des virus comme le HIV, le virus de la grippe A ou le coronavirus du SARS où les sources du virus réside dans la même espèce avec un R0>1.

Dans la situation intermédiaire, ou R0~1, l'importance de l'épidémie est très sensible à de faibles variation de R0. Et il y a de nombreuses possibilités de variations de R0.selon la situation et le comportement du nouvel hôte.

L'une des conditions de l'apparition d'un risque est liée aux possibilités de rencontre entre pathogène et un hôte naturellement ou momentanément sensible, et cela est facteur à la fois du pathogène et de l'hôte en question. Cela inclut, évidemment, les vecteurs avec, pour eux, le même problème de saut d'un vecteur existant à un autre seulement potentiel.

La capacité à infecter le nouvel hôte vient ensuite, et c'est le problème actuel, pour la grippe aviaire asiatique H5N1. Les récepteurs conservés sont un indice de problèmes à venir, le rôle du porc dans ce dernier cas est à souligner de ce point de vue, et c'est également le cas pour le virus de la fièvre aphteuse avec son récepteur vitronectine. Mais, au moins aux débuts d'une infection hétérologue, l'infectivité du pathogène est très faible. Ainsi les doses pour transmettre la rage d'un renard à un chat ou un chien sont 106 fois supérieures à celle pour une transmission entre renards. Mais la sélection va jouer en faveur d'une adaptation avec passage entre individus de l'espèce hétérologue. Dès que R0>1 il y a une épidémie en devenir. Cela a été le cas pour le virus West Nile en Amérique du Nord.

Cette adaptation du pathogène peut impliquer des modifications du génome de quelques nucléotides comme dans le cas du parvovirus canin (virus de la panleucopénie du chat qui a ainsi acquis une capacité d'utiliser le récepteur transferrine du chien) ou du virus de la fièvre aphteuse, de gènes complets comme dans le cas de bactéries entériques, à des recombinaisons ou des réarrangements génomiques plus complexes (virus grippal ou maladie de l'orme avec Ophiostoma novo-ulmi) ou l'hybridation, comme dans le cas de Phytophthora alni des aulnes qui est un hybride allopolyploïdes entre un pathogène du bois récemment introduit, Phytophthora cambivora et un Phytophtora local spécialisé dans les fraisiers et les framboisiers.

La probabilité d'une telle adaptation dépend évidemment du nombre d'infections initiales et de leur succès (un R0 voisin de 1 amorce la sélection indiquée plus haut). La probabilité d'émergence croit linéairement avec la fréquence d'infections initiales, mais elle est nettement non linéaire par rapport à R0.

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4.###.V Schramke et al.; Nature 435 (30JUN05) 1275-1279 montrent que les modifications de la chromatine induites par l'interférence ARN (RNAi) causée par les siRNAs chez Schizosaccharomyces pombe sont concomitantes à la transcription par l'ARN polymérase II (celle qui transcrit les messagers). Voir également le commentaire de Buratowski et al.; Nature 435 (30JUN05) 1174-1175. Une confirmation de cette découverte est d'ailleurs parue avec H Kato et al.; Science 309 (15JUL05) 467-469. Cela signifie que le mécanisme de la RNAi fait intervenir la machinerie de l'expression génique elle-même.

Dans le cas étudié, c'est plutôt le complexe RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing) qui intervient. Le sort du messager est fixé dès la transcription qui déclenche la machine interférente.

RITS réprime la transcription en agissant sur la chromatine qui est méthylée grâce au recrutement d'une histone méthyltransférase. L'ADN entourant le nucléosome devient alors inaccessible à la machinerie de transcription. De toute façon, on savait que la transcription induit des modifications de la chromatine, car deux autres méthyltransférases (Set1 et Set2) se lient également à la pol-II au niveau des gènes transcrits et on a même des échanges d'histones lors du passage du complexe de transcription qui ne comporte pas seulement pol-II. L'une des multiples modifications de la chromatine par le complexe est peut être impliqué dans le "silencing". L'article de H Kato et al. semblent indiquer que même la production des siRNAs est associée au complexe.

Chez les plantes la pol-IV qui est apparemment impliquée dans la synthèse des précurseurs des siRNAs (voir la très bonne revue de MW Vaughn et al.; Molecular Cell 17 (18MAR05) 754-756) pourrait suggérer que pol-IV peut passer à travers des structures chromatiniennes qui bloquent pol-II. Il faudrait voir si la transcription par cette ARN polymérase intervient dans le "silencing", ce que suggèrent H Kato et al.. Il faudrait alors établir si les siRNAs sont également engendrés pendant la transcription, et si les messagers destinés à une destruction sont utilisés pour donner les siRNAs. Il faudrait pour cela faire intervenir les ARN polymérases ARN-dépendantes donnant les ARNs doubles brins et Dicer qui les découpe. Les complexes RITS et RISC pourraient être associés au site de transcription.

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5. La production des siRNAs dépend de RNases dites de type III, donnant miRNAs (classe 2) ou siRNAs (classe 3). Elles font partie des mécanismes de défense contre les virus chez les eucaryotes.

Mais on vient de montrer qu'une RNase III de classe 1 joue en sens inverse, neutralisant le "silencing". JF Kreuse et al.. Journal of Virology 79,n°11 (JUN05) 7227-7238.

Cela a été démontré au cours d'une infection par le sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV), un virus à ARN simple-brin de la patate douce (Ipomœa batatas). Ce virus code lui-même cette RNAse III (Rnase 3) homologue de RNases III de classe 1 du riz et d'Arabidopsis, mais dont la fonction est inconnue. Cette RNase3 agit de concert avec une autre protéine virale (p22), et réduit la quantité des siRNAs chez Nicotiana benthamiana. Elle est sans effet sur ce point en l'absence de p22.

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6. ### Les virus multipartites encapsidant plusieurs sous-unités génomiques dans une même capside posent toujours le problème de savoir comment ils trient les séquences à encapsider (exemple la grippe avec huit segments différents). PA Venter et al.; Journal of Virology 79,n°10 (MAY05) 6239-6248 montrent, chez le Flock House Virus (FHV, un nodavirus d'insectes), que l'encapsidation de segments nécessite une réplication simultanée de l'ARN viral. Il y a un couplage réplication/traduction/encapsidation qui n'était pas connu auparavant.

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7. *** Les gènes soumis à empreinte parentale le sont lors de la gamétogenèse. Cette empreinte suppose que ces marquages échappent aux reprogrammations après la fécondation et sont fidèlement conservées au cours du développement. JF Wilkins; Trends in Genetics 21 (JUN05) 356-365 s'est penché sur ces systèmes soumis à des sélections contradictoires.

La revue porte essentiellement sur les méthylations et déméthylations dans l'embryon pré-implantaire et la stabilisation de l'information épigénétique au cours du développement et au passage des générations. Elle s'attarde sur les théories évolutives de l'empreinte et des conflits qu'elle entraîne. .

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8. ### Une revue sur l'interférence ARN (RNAi) et sur les mécanismes de "silencing" de R Almeida et al.; Trends in Cell Biology 15 (MAY05) 251-258 (une de plus me direz vous) discute plus particulièrement des régulations de l'expression du génome par ce processus.

La signification biologique de ces mécanismes dans la régulation de l'expression génique, le maintien de l'intégrité du génome et de sa structure commence à être clarifiés, mais la revue porte plus sur leur rôle dans d'autres phénomène épigénétiques régulant l'expression des génomes eucaryotes.

La revue présente un avantage sur d'autres, de placer chacun des acteurs à la place qu'on lui attribue actuellement, en distinguant les particularités des mécanismes dans les différents organismes étudiés jusqu'à présent, en particulier l'apparente absence d'amplification des ARNs doubles brins chez les Vertébrés, comme chez la Drosophile.

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Les Productions Végétales

Les gènes et les génomes

9. ### Les céréales ne sont pas, comme on le sait bien, des aliments bien équilibrés, bien qu'elles constituent souvent la quasi-unique base de l'alimentation humaine. Les aliments des animaux également monogastriques posent également des problèmes, notamment avec le maïs et sa carence en lysine (1 à 2% au lieu des 5% nécessaires à l'homme).

BC Gibbon et al.; Trends in Genetics 21 (APR05) 227-233 traitent de l'amélioration des maïs à partir des mutants opaque 2 (o2) enrichis en lysine mais non commercialisable en l'état du fait d'une pléthore de défauts. On a commencé à mettre sur le marché, il y a une vingtaine d'années, des maïs à protéines améliorées (QPM) dans de nombreuses régions en développement. Ces maïs ont une texture et une composition en protéine optimisée. Les recherches récentes sur les mutants opaque2 et les mécanismes permettant de supprimer son phénotype farineux et "mou" indiquent comment on peut continuer à améliorer ces QPMs. L'utilisation de la transgenèse facilite les améliorations de la texture de l'albumen en jouant sur la structure des grains.

Le grain de maïs comporte un albumen volumineux avec plusieurs régions. L'aleurone, périphérique, est composé de cellules spécialisées qui vont donner les enzymes nécessaires à la germination. L'albumen sous-jacent est formé d'amidons (90%) et protéines (10%) avec deux zones, l'une périphérique, vitreuse, et l'autre plus interne, dite amylacée.

Chez un maïs typique "dent de cheval" ou "indenté" (le "dent corn"), seules les faces latérales de l'albumen ont une structure vitreuse ce qui, par dessiccation de l'albumen farineux axial, entraîne la formation d'une dépression au sommet du grain.

Par ailleurs, environ 70% des protéines sont diverses prolamines, appelées zéines stockées dans la lumière du réticulum endoplasmique et qui sont pauvres en lysine.

La mutation opaque2 (o2) déprime, en réalité, la synthèse de zéines ce qui rend l'ensemble de l'albumen farineux (opaque alors que la couche vitreuse est translucide) où les grains d'amidons sont moins cohérents du fait de la perte des -zéines de 27 kDa, et augmente la proportion de protéines riches en lysine, mais aux dépens du rendement en protéines globales (bien qu'il y ait une certaine compensation) et de la texture du grain qui reste mou, cassant et sensible aux attaques d'insectes. Ces grains ont également des difficultés de germination.

Ce n'est que beaucoup plus tard après sa découverte, que des modificateurs de ces défauts de texture ont été découverts par les sélectionneurs. Mais il fallait également obtenir un accroissement des protéines totales, et ceci a été progressivement réalisé.

L'identité des gènes assurant la formation de la partie vitreuse de l'albumen est difficile à établir. Mais les -zéines de 27 kDa qui amorcent les granules protéiques sont en quantité double chez les mutants o2 améliorés par le modifieur mo2 ce qui doit contribuer à une structure plus ferme de l'albumen.

Les réseaux d'expression ont montré que des mutants opaque, dans un même contexte génétique, ont des effets pléiotropes sur de nombreux gènes. Ceci rend d'ailleurs la caractérisation des voies conduisant au caractère "mou" de l'albumen très difficile.

Une des caractéristiques intéressantes est la stimulation de la vérification des protéines, comme si les cellules sentaient que quelque chose ne va pas. Mais pour certaines mutations comme o1, tout semble, par ailleurs, normal.

Les profils d'expression sont parfois déconcertants car les transcrits de protéines de réserve stimulés diffèrent beaucoup selon les mutations. Ceux des -globulines sont accrus dans le cas de o5, ceux de légumines pour les mutants o2, o11, fl2, Mc et De-B30. Au niveau du protéome, ce sont les globuline 1 et la petite GTPase rab2 chez o2, etc…

L'-globuline du maïs contient un motif semblable à celui des puroindolines du blé qui sont impliquées dans la dureté de l'albumen, ce qui fait penser que les globulines de réserve du maïs ont également ce rôle. Mais un rôle important des -zéines de 27 kDa codée par un jeu de gènes en tandem au voisinage du centromère du chromosome 7 est plus que probable, allié à un autre locus proche d'un des télomères du même chromosome, gènes associés au modifieur mo2.

Des protéines non zéines interviennent également dans le caractère vitreux, et l'une d'entre elles est la GBSS-I (Granule Bound Starch Synthase 1) qui est le produit du gène Waxy1 et dont la quantité ne varie pas, mais qui est plus facilement extractible des amidons des o2 et mo2, ce qui indique un changement de structure des grains d'amidon (probablement lié aux ramification de l'amidon).

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10. Les miRNAs ont été découverts en 1993 chez Caenorhabditis elegans puis, en 1999, cela a été le tour des siRNAs et de leur rôle dans le PTGS (PostTranscriptional Gene Silencing) chez les plantes.

On a, depuis, découvert des centaines de gènes codant des miRNA chez les animaux et les plantes et divers loci codant des siRNA endogènes chez les plantes et les champignons. Ces acteurs de l'interférence ARN (RNAi) et son association avec la formation de l'hétérochromatine a précisé l'importance de ces découvertes dans les régulations (voir le §8).

JC Carrington; Plant Physiology 138 (JUN05) 565-566 se risque à prévoir un certain nombre de conséquences et surtout de questions qui vont se poser.

La plupart des mi RNAs et certains des siRNAs codent des facteurs de transcription impliqués dans le développement des plantes. Ainsi, miR160 et miR167 ciblent des gènes de facteurs de transcription impliqués dans les réponses à l'auxine. D'autres inactivent l'expression de gènes régulant les fonctions méristématiques et de leur patron d'expression.

Une question importante est de savoir comment l'expression des miRNAs est, elle-même, régulée.

Des outils sont en cours de mise au point pour éclairer les mécanismes d'action des miRNAs sur une grande échelle. L'époque où on inactivait un miRNA donné puis on analysait la panoplie des gènes inhibés et en voie de se terminer et on cherche à établir, en une seule étape, les miRNAs actifs, leurs gènes cibles et les gènes dont l'expression est modifiée en aval. Pour cela, on cherche à inactiver globalement tous les miRNAs d'une famille donnée (ce qui limite les problèmes posés par leur redondance).

La batterie de base de facteurs intervenant dans la RNAi est connue et conservée avec les protéines Dicer-like (DCL), Argonaute et ARN polymérase ARN-dépendante (voir le §8).

La protéine DCL contient deux domaines RNase-III s'attaquant aux ARNs double brin tandis qu'Argonaute possède un domaine RNase H-like. Ces protéines ont toutes deux donné une famille grandissante de membres chez les plantes fournissant les acteurs spécialisés dans les voies des miRNA, des siRNA, de l'interférence liée à la formation de l'hétérochromatine et de la lutte contre les éléments étrangers, dont les virus. Mais la pléthore des Argonautes (dix chez Arabidopsis ) et d'une partie des protéines DCLs reste à expliquer sur le plan fonctionnel. On ne connaît le rôle dans le clivage des messagers cibles par les miRNAs et siRNAs que dans le cas d'AGO1 et AGO4, et un troisième de ces facteurs (ZIPPY) a été impliqué dans la transition du stade juvénile vers adulte. Il doit exister bien d'autres fonctions, et l'évolution n'est pas terminée.

Il semble que de nouveaux petits ARNs régulateurs puissent résulter de duplications permettant la formation d'ARN en épingle à cheveux. Ce n'est probablement pas le seul mécanisme possible.

Il faudrait que, comme chez les animaux, des essais in-vitro soient possibles pour préciser les fonctions.

On pourrait alors avoir la réponse à la question de savoir comment les différentes classes de petits ARNs se forment. L'auteur pose également la question de savoir comment les complexes de la RNAi s'intègrent dans les autres processus cellulaires. Ainsi DCL3, RDR2, AGO4 participent à la formation de l'hétérochromatine en de nombreux loci. Cela fait beaucoup de choses à intégrer, d'autant qu'une ARN polymérase particulière aux plantes (pol4 ou SDE4 ou RPD venant s'ajouter aux trois polymérases des eucaryotes RPA, -B et -C) semble impliquée dans la RNAi associée à l'hétérochromatine.

On aimerait, par ailleurs, mieux cerner le rôle éventuel de la circulation intercellulaire puis dans toute la plante des petits ARNs (via les plasmodesmes et le phloème). On sait depuis une dizaine d'années qu'une information nucléique séquence-spécifique circule à courte et longue distance.

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11. Le rôle des miRNAs dans la régulation de la morphologie des plantes est évoqué par MJ Axtel et al.; The Plant Cell 17 (JUN05) 1658-1673.

Les auteurs utilisent un réseau permettant de détecter ces activités et de comparer leur présence avec celle des messagers correspondants. Ils ont également utilisé cet outil pour analyser la phylogénie des miRNAs.

Des 23 familles de miRNAs analysées, l'expression de onze d'entre elles a été détectée chez les Gymnospermes et huit chez les Fougères. En fait, tout indique qu'ils sont restés stables depuis l'apparition des plantes à fleur. Il est donc possible de retrouver chez Arabidopsis des miRNAs existant chez les mousses et les fougères et que l'évolution n'a fait qu'ajouter de nouveaux miRNAs.

La plupart des cibles des miRNAs connus chez Arabidopsis codent des protéines ayant un rôle dans le développement. Ainsi miR159 et miR319 interviennent dans les patrons floraux et foliaires, miR172 dans le développement floral (en inhibant la traduction d'APETALA2 par exemple) et dans la chronologie de ce développement, miR165/166 dans la polarité des organes et le développement vasculaire, miR164 dans la séparation entre les organes et le nombre des organes floraux, miR168 dans la distribution des feuilles le long de la tige (phyllotaxie), le maintien du méristème caulinaire apical et la fertilité, miR160 dans la forme des feuilles de la rosette et l'expression des gènes de réponse précoce à l'auxine.

Une mutation inactivant le locus Dicer-Like 1 (DCL1) codant une endonucléase impliquée dans la formation des miRNAs entraîne une létalité embryonnaire plus générale.

La conservation de ces miRNAs est manifeste, et on en retrouve la plupart chez le riz avec les mêmes séquences de reconnaissance de leurs cibles. Cette conservation s'étend comme évoqué plus haut à des plantes sans fleurs.

Les miRNAs de la famille miR165/166 sont fonctionnels chez le blé et le maïs et pilotent le clivage de messagers de Selaginella kraussiana (Lycopodinée, fougères primitives), ce qui prouve que le mécanisme régulateur miR165/166 est resté intact depuis le démarrage de l'évolution des plantes vasculaires. Plus généralement, les cibles récemment identifiées de miR160, miR167, miR170/171, et miR172 chez les plantes primitives (sans fleurs) sont toutes homologues de cibles chez Arabidopsis.

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13. Certaines cellules subissent une endoréplication (réplications successives de leur ADN sans distribution mitotique entraînant une polyploïdie progressive). On n'a guère d'idées sur la mise en route de cette voie dérivée de la duplication normale du génome. On l'observe, par exemple, lors du développement de la feuille et du fruit, et dans la formation de l'albumen du maïs. Le basculement comporte la perte d'une activité kinase. Le groupe de D Inze montre qu'un inhibiteur de kinase cycline dépendante, CDKA;1 (KRP2, pour Kip-Related Protein 2), régule le déclenchement de cette endoréplication en stimulant le complexe de réplication sans déclencher la mitose. A Verkest et al.; The Plant Cell 17 (JUN05) 1723–1736.

Arabidopsis possède sept gènes codant cet inhibiteur apparenté aux inhibiteurs de CDK Kip/Cip de Mammifères. Leur surexpression donne de petites feuilles en dents de scies du fait de la réduction du nombre de cellules. Cet inhibiteur délivré juste au dessus de son niveau normal ne perturbe que le complexe kinase dans sa fonction mitose spécifique, sans toucher à sa fonction d'endoréplication. L'inhibiteur est plus abondant dans une cellule en endoréplication. L'abondance de KRP2 dépend de sa phosphorylation par une CDK et de sa dégradation dans le protéasome. La phosphorylation de KRP2 par la kinase CDKB1;1, qui est mitose-spécifique, régulerait le niveau d'activité de CDKA;1 en modulant l'abondance de KRP2.

La transition de la mitose de la phase S (de duplication de l'ADN) à la phase M (mitose) est assurée par l'activation séquentielle de complexes dimériques comportant une kinase cycline dépendante (CDK) et d'une sous-unité cycline régulatrice.

Le groupe avait déjà montré que CDKB1;1 joue un rôle déterminant dans l'arrêt différentiel de la mitose, tout en conservant le processus de duplication de l'ADN.

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14. ### Arabidopsis se prête bien à une analyse de la diversité génétique, ne serait-ce que du fait de la diversité de ses écotypes. Mais trouver les gènes responsables de cette variabilité des accessions disponibles est un affaire un peu plus compliquée que D Weigel et al.; Plant Physiology 138 (JUN05) 567-568 cherchent à éclairer.

Une des difficultés rencontrées (et bien connue des sélectionneurs), est que les cas où un seul gène détermine ces différences avec une belle distribution mendélienne sont rares. Le cas le plus fréquent est l'addition de variations alléliques de plusieurs loci avec une contribution faible de chacun. D'où l'utilisation de ce que l'on appelle les QTLs (Quantiative Trait Loci). Mais cette détermination cartographique prend beaucoup de temps si on veut le cartographier finement puis le cloner et le séquencer.

Les auteurs s'inspirent des suggestions du consortium de génétique quantitative des Mammifères (Complex Trait Consortium établi en 2003), mais avec des adaptations aux plantes..

Le verrou réside dans le positionnement et la caractérisation initiaux du QTL. Dans le cas d'Arabidopsis il est possible d'utiliser le déséquilibre de liaison par détection de variantes de séquences associées au phénotype. Cette facilité est liée au fait que les déséquilibres de liaison se dégradent rapidement chez cette plante, au delà de 25 à 50 kb, les recombinaisons disloquent toute liaison. Si l'association est significative on est très près du QTL. Les auteurs ont ainsi montré que l'on peut placer FRIGIDA à environ 30 kb d'un marqueur. Mais, là comme ailleurs, on a une corrélation mais pas forcément une démonstration directe.

Les polymorphismes d'une paire de nucléotides sont en cours de détermination chez 20 lignées d'Arabidopsis en utilisant les techniques mises au point chez l'homme.

KK Shimizu et al.; Plant Physiology 138 (JUN05) 576-584 ont entrepris une étude un peu du même genre. Ce type d'études consiste à placer les études génomiques dans leur contexte écologique et évolutif. Les études évolutives analysent comment la sélection, la dérive génétique (liée à une réduction très forte et aléatoire du pool génétique), et l'histoire évolutive vont modeler la variabilité d'une espèce. Les auteurs se rabattent également sur Arabidopsis.

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15. Identifier des mutations ponctuelles dans un génome hexaploïde comme celui du blé tendre relève de l'exploit. Un article d'AJ Slade et al.; Nature Biotechnology 23 (JAN05) 75–81 et AJ Slade et al.; Transgenic Research 14 (APR05) 109-115, commentés par C Weil; Trends in Biotechnology 23 (MAY05) 220-222 montrent que cela est possible grâce à la technique de TILLING (Targeting Induced Limited Lesions IN Genomes) qui avait été analysée par S Hennikoff et al.; Annual Review in Plant Biology 54 (2003) 375–401 chez Arabidopsis et que le groupe étend actuellement au maïs, si je me rappelle bien.

La technique permet d'inactiver tous les homologues d'un gène par une méthode non transgénique grâce à une mutagenèse massive. AJ Slade et al. ont ciblé le gène waxy (wx) codant la GBSS (Granule-Bound Starch Synthase) dont la mutation entraîne l'absence d'amylose. Il a toujours été difficile de construire des lignées hexaploïdes commerciales ne produisant pas d'amylose.

La seule façon dont on a pu le faire a consisté à introgresser des mutations wx à partir de germplasmes exotiques, entraînant avec eux de nombreux caractères peu souhaitables.

L'étude de Slade et al. consistait à mutagéniser et cribler une variété de blé hexaploïde portant deux gènes mutés wx dans les génomes A et D, tandis que le génome B en est naturellement dépourvu, ainsi qu'un blé tétraploïde avec la version A et B de wx. Il disposait donc des trois gènes wx (A,B et D).

Le fait que le blé soit hexaploïde est une gêne, mais aussi une aide, car on peut forcer dans la mutagénisation par l'EMS (Ethyl Méthane Sulfonate) car il reste toujours un gène intact pour permettre à la plante de survivre. Ils ont ainsi introduit une mutation toutes les 24 kb chez l'hexaploïde et toutes les 40 kb chez le tétraploïde. Ils ont utilisé, ensuite des paires d'amorces permettant de repérer spécifiquement chaque version de wx.

Ils ont ensuite pu identifier un grand nombre de mutations dans leurs trois cibles wx. Ils ont criblé un dixième des ~18 000 mutants, et on déjà découvert une série de 250 mutations dans la portion analysée des trois loci waxy, et en ont caractérisé plusieurs.

Les choses sont devenues réellement intéressantes quand on a combiné divers variants parmi ces mutants. Les résultats les plus spectaculaires ont été obtenus en combinant des allèles à effet individuel sévère, allant jusqu'à une suppression totale de l'amylose, chose qui est difficile à réaliser par introgression de loci provenant de germplasmes exotiques.

On peut donc espérer obtenir, par une sélection classique assistée, des amidons sur mesure avec une proportion commercialement intéressante. Il faudrait accélérer le processus de sélection et effectuer rapidement les croisements en retour indispensables pour nettoyer le génome des scories génétiques inévitables.

La technique est plus facile à appliquer quand on connaît la séquence génomique, sa valeur a été démontrée chez Arabidopsis, mais le passage au blé (et celui en cours sur le maïs) montre qu'il suffit de bien connaître le gène cible. L'empilement des gènes est une stratégie classique dans l'amélioration des plantes, la possibilité d'utiliser une approche de génétique reverse pour choisir ou améliorer les allèles (par mutations) que l'on empile, même si le phénotype ne permet pas de les détecter directement, vient la compléter. Le fait que le cumul d'allèles à faible effet individuel donne des synergies très fortes le souligne. Les polyploïdes comme le blé ou le soja renforce les possibilités (voir plus haut).

Le cas de wx est, en réalité un cas simple. Il y a bien six allèles possibles chez le blé. Mais supposons que cela ait été une famille d'une dizaine de gènes!!! Il va falloir alors développer des familles d'amorces discriminatoires en conséquence.

Cette technique est plus consommatrice de temps et de travail que le "silencing", par exemple par virus interposé, dans une stratégie d'analyse du fonctionnement génomique, mais si elle est admissible pour des études fonctionnelles, elle n'apport rien à l'amélioration des plantes où les résultats doivent être stables et permanents. TILLING a l'avantage de ne pas nécessiter un phénotype apparent au départ.

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La transformation génétique

17. L'utilisation de transformations transitoires par virus peut être améliorée. Ces techniques ont quelques avantages dans certaines situations. La première est la rapidité des résultats, la possibilité d'une généralisation à toute la plante. Les défauts actuels observés sont la faible infectivité d'un vecteur viral surchargé par un transgène de taille, même relativement modérée. On peut utiliser directement un virus comme le virus de la Mosaïque du Tabac (TMV), mais le plus souvent on utilise un cDNA introduit par Agrobacterium. S Marillonnet et al.; Nature Biotechnology 23 (JUN05) 718-723 (de la firme Icon Genetics de Halle en Allemagne, avec Youri Gleba) montrent qu'avec quelques modifications le rendant plus semblable aux messagers, le TMV permet d'infecter toutes les cellules d'une feuille, ce qui améliore très sensiblement la production de protéines in planta. Voir également le commentaire de SB Gelvin; Nature Biotechnology 23 (JUN05) 684-685.

Les auteurs estimaient que les cDNA troublent la réplication d'un virus ARN fait pour être toujours cytoplasmique, alors que l'expression nucléaire pourrait en être gênée, ne serait ce que par la maturation des pré-mARNs qui pourrait utiliser des sites cryptiques d'épissage (normalement pas contre-sélectionnés pour un virus cytoplasmique) permettant le clivage intempestif du génome viral. Ils les ont recherchés et les ont modifiés en remplaçant par des substitutions neutres pour la protéine codée par le transgène. Il en a quand même fallu 97 pour le transgène modèle de la GFP.

Ils ont introduit jusqu'à 14 introns dans les séquences virales et le transgène modèle., ce qui a encore augmenté le niveau d'expression et diminuer de 1000 fois le nombre d'infections par Agrobacterium nécessaires pour amorcer une production dans Nicotiana benthamiana, et encore plus chez Nicotiana tabacum. Il suffit d'immerger la plante dans une suspension bactérienne et d'appliquer un léger vide pour obtenir une infection de la quasi totalité des cellules de la plante.

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18. L'ingénierie génétique des chloroplastes est intéressante, car elle correspond à un confinement maternel naturel, permet une transformation multigénique d'un seul coup, une expression élevée, la possibilité d'isoler les protéines produites par rapport au cytoplasme où elles pourraient être toxiques (cas du tréhalose, par exemple), et surtout l'absence de tout silencing. On sait bien la pratiquer chez le Tabac, ce qui permet de produire des protéines pharmaceutiques, mais pas chez les grandes cultures. On a déjà réussi ce type de transformation chez le soja, la carotte et le coton, mais par embryogenèse somatique après transformation de cellules en cultures avec des vecteurs chloroplastiques. H Daniell et al.; Trends in Biotechnology 23 (MAY05) 238-245 viennent de publier une revue sur ce sujet.

La capacité d'exprimer un opéron complet comme l'opéron cry de Bacillus thuringiensis et ainsi possible avec un seul évènement de transformation et une expression pouvant s'élever à 46% des protéines foliaires de la protéine insecticide. Cette expression chloroplastique garde son efficacité à la protection contre les insectes ravageurs. L'utilisation de sites d'insertion dans les régions intergéniques évite d'avoir les effets de position souvent observés dans une transformation nucléaire, mais surtout permet de ne pas introduite les séquences du vecteur puisqu'on dispose dans le chloroplaste de la recombinaison homologue).

Mais on rencontre de grandes difficultés, même chez Arabidopsis, dans l'efficacité e la transformation et du fait de stérilités qui obligent à des greffes pour obtenir une descendance dans le cas de Lesquerella (une plante oléagineuse de Patagonie). Les évènements sont rarissimes chez le soja où le riz. Les auteurs analysent les succès chez la carotte, avec la transformation chloroplastique par le gène badh de la bétaïne aldéhyde déshydrogénase pour faciliter la culture en terrains salins qui a été réalisée par un des signataires de la revue (S Kumar et al.; Plant Physiology 136 (SEP04) 2843-2845). C'est également une plante idéale pour la production de protéines pharmaceutiques pour ingestion. Sa transformation En ce qui concerne le coton il existe des risques certains de contamination génétique de cotons sauvages dans certaines régions du globe et la culture de cotons transgéniques nucléaires y est donc prohibée. Si on pouvait argumenter un confinement suffisant par une expression chloroplastique on serait plus tranquille. Par ailleurs l'expression nucléaire de la protéine Bt est souvent insuffisante et des traitements additionnels, mais limités, par des pesticides de synthèse sont nécessaires. La transformation chloroplastique a pu être réalisée (S Kumar et al.; Plant Molecular Biology 56 (SEP04) 203-216). Le cas du soja, où N Dufourmantel du CEA à Cadarache (une des signataires) avait réussi une expression chloroplastique, malgré les difficultés (N Dufourmantel et al.; Plant Molecular Biology 55 (JUL04) 479-489), est également analysé.

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Le développement

20. On a considéré, jusqu'à présent, la prolifération cellulaire et celle de ses organites comme deux processus indépendants, bien qu'on puisse supposer qu'ils soient complémentaires. C Raynaud et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 102 (07JUN05) 8216-8221 montrent que les protéines CDT1a et CDT1b (pour Cdc10 Dependent Transcript 1) d'Arabidopsis, qui sont des membres du complexe de préréplication qui permettent de charger le complexe MCM (MiniChromosome Maintenance) sur l'ADN, interviennent aussi bien dans les deux processus de réplication de l'ADN nucléaire et de la division des chloroplastes.

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21. Le Physalis (Coqueret) est une Solanacée qui a hérité d'une monstruosité, son calice qui se développe après la fécondation formant une sorte de lanterne chinoise. Cette difformité esthétique est due à l'activation intempestive, dans la fleur, d'un facteur de transcription à MADS-box appelé STMADS1 chez la pomme de terre (ST), mais uniquement exprimé dans les
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