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3 • LE PRION NORMAL PrPC : UNE PETITE GLYCOPROTÉINE À LA SÉQUENCE ENTRE ESPÈCES ANIMALES BIEN CONSERVÉE




Le prion normal PrPc , une protéine du soi, dont la séquence est bien conservée au cours de l'évolution.



La protéine prion de l'individu normal non contaminé ou PrPc (c pour cellulaire) est une glycoprotéine (PM = 33 à 35 kDa, selon le taux de glucides). Cette isoforme est constituée chez l'Homme, d'une chaîne polypeptidique de 253 acides aminés (254 chez la Souris), dont la séquence est connue depuis 1986.

Elle est bien conservée au cours de l'évolution, car son degré d'homologie entre espèces est le plus souvent supérieur à 85 % [1, 6, 13, 31].

Dans la structure de la protéine prion PrPc, on retrouve un peptide signal (SP) hydrophobe de 22 acides aminés dans la région amino-terminale, qui est clivé lors de la biosynthèse, après l'entrée dans le réticulum endoplasmique rugueux (RER). Le peptide signal permet la translocation de la protéine dans le RER. Dans cette région on trouve une répétions de 5 octapeptides de séquence consensus PHGGGW cette région qui contient notamment des restes histidine peut se lier entre 4 à 6 atomes de cuivre. Un site de clivage (site β) semble exister dans cette région octapeptidique.
Ensuite on trouve une partie G-P comme indiquée sur la Figure 3 et qui correspond à une région riche en motifs Glycine-Proline.




Principaux Acides-aminés rencontrés dans la protéine Prion.
L
Le PrPc présente dans sa structure secondaire une majorité de structures en hélice alpha
a suite de la séquence comporte une région dite 96-112 STE (Stop Transfer Effector) supposée contrôler la topologie de la protéine, et qui semble jouer un rôle important dans le changement de conformation dans le passage PrPc à PrPres. Dans cette région hydrophobe (hélice ) très concernée on trouve aussi un site de clivage entre les acides aminées 111 et 112. On localise ensuite une région transmembranaire (région TM) et enfin, une zone qui contient trois structures en hélice alpha (H1 à H3) et une zone de feuillets bêta 7. Ces structures sont reliées entre elles par des boucles polypeptidiques.

Les cystéines 179 et 214, liées par un pont disulfure(-S-S-), contribuent à former une boucle sur laquelle se situent deux sites de glycosylation (sites CHO, au niveau des asparagines 181 et 197 sur la figure 3). Enfin la sérine 231 est liée à un enchaînement glycophosphatidylinositol (site GPI), qui permet à la protéine PrPc de s'ancrer sur la face externe de la membrane plasmique cellulaire. Fait surprenant, la PrPc est la première protéine dans laquelle la partie d'ancrage GPI est constituée principalement d'acide sialique.





Schématiquement la structure de la protéine prion normal PrPc

peut être représentée comme l'indique la figure 3
Site de liaisons du cuivre

Octapeptides


S-S

C

CHO

GPI

TM

AH

SS

5'

1

22

96

112

135

181

197

253

3'

HO









179


214



50


Partie G-P

231








Figure 3

Structure schématique de la protéine native prion PrPc humaine

En résumé, la protéine prion humaine, formée initialement de 253 acides-aminés, subit dans la cellule une maturation correspondant à l’élimination d’abord d’une séquence signal N-terminale (22 acides-aminés) puis d’un séquence signal C-terminale (23 acides aminés) aboutissant ainsi à la PrPc constitué au final de 209 acides aminés.

L
La structure tridimensionnelle du prion de différentes espèces (Souris, Hamster, Bovins, Homme) a pu être déterminée par RMN.
es données sur la structure tridimensionnelle de la protéine Prion des mammifères ont été jusqu'à présent obtenues grâce à la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN).

Ainsi par spectroscopie RMN, Kurt Wüthrich9 et ses collaborateurs de l'Institut de Biologie moléculaire et de Biophysique de Zurich, ont déterminé la structure tridimensionnelle du prion normal (PrPc), d'abord celle de prion de la Souris (1996) [36a,36b, 57] puis celle du prion de l'Homme (Janvier 2000) et celle du prion bovin (février 2000) [36d]. De son coté, Stanley Prusiner a déterminé la structure du prion de l'Hamster (1996).

Ces analyses par RMN mettent en évidence que les prions bovin et humain ont une structure spatiale très proche, ce qui permettrait leur transmission assez facile d'une espèce à l'autre.

Par contre les prions de la Souris ou de l'Hamster ont des silhouettes un peu différentes de celles des prions bovin et humain.

D'une manière générale, la RMN montre que la protéine prion normal PrPc de mammifères possède deux parties bien distinctes.Une première partie compacte, plutôt sphérique, est constituée d'une centaine d'acides-aminés (des acides-aminés 121 à 230 dans le prion bovin) regroupés sous forme de trois hélices alpha et d'un court feuillet bêta.

L
L'analyse spectrale par RMN du prion normal (PrPc) permet de distinguer une partie compacte comportant trois hélices alpha et un court feuillet bêta.

La seconde partie correspond à une longue chaîne polypeptidique qui peut fixer du cuivre.
a seconde partie, de taille à peu près identique ( des acides aminés 23 à 121 dans le prion bovin) est entièrement flexible et dynamique, changeant constamment et rapidement de forme.

Cette queue flexible, qui peut fixer des ions métalliques divalents comme les cations cuivriques (Cu2+)et avec une affinité moindre le zinc (Zn2+) et le manganèse (Mn 2+) peut entrer en contact avec d'autres protéines prion et former ultérieurement des dimères puis des polymères de prions pathogènes (PrPres).

Par modélisation moléculaire, l'équipe suisse de Ralph Zahn (Zurich) [57] a mis en évidence, qu'à sa surface, la protéine prion bovine PrPc présente sur un site une charge négative, ce qu'on n'observe pas sur le prion humain. Cette différence de charge électrique de surface, pourrait expliquer, au moins en partie, la barrière d'espèce qui protège partiellement l'Homme de l'ESB.
Dès 1997, David Brown de l'Université de Cambridge [38a] mis en évidence que dans la protéine prion normal (PrPC), la partie N-terminale avait la capacité de fixer fortement les ions cuivriques (Cu2+) grâce à une motif répétitif de 8 unités riche en histidine. Il a été avancé que la protéine PrPc pourrait, ainsi jouer un rôle important dans la métabolisation du cuivre, au niveau du cerveau, en particulier dans le transport et le stockage de cet oligo-élément [38b].

L
Le prion fixe les ions Cu2+ et pourrait jouer un rôle dans la biodisponibilité cérébrale du cuivre et intervenir comme agent anti-oxydant protecteur.
e prion ayant fixé du cuivre (en général 2 ions cuivriques par motif octapeptidique) présente une activité anti-oxydante proche de celle des superoxyde-dismutases (SOD), métalloprotéines cellulaires très importantes, pouvant renfermer divers métaux (Cu, Zn, Fe, Mn et même Ni chez certaines bactéries). Le prion PrPc présente donc in vivo une activité SOD-like qui serait dans les conditions physiologiques dépendantes du cuivre et éventuellement du zinc.
Ces enzymes localisées dans le cytoplasme ou dans les mitochondries ont pour rôle principal de transformer l'anion-superoxyde (O2. ̄) premier produit de la réduction à un électron du dioxygène (O2) en peroxyde d'hydrogène ou eau oxygénée (H2O2).

Ce peroxyde d'hydrogène doit à son tour être détruit soit par la glutathion-peroxydase ou SeGpX (enzyme à sélénium) soit par la catalase ( peroxydase à fer) afin d'éviter l'initiation d'un processus d'agression oxydante. Selon David Brown [38b], le prion normal ayant fixé du cuivre, fonctionnerait alors au niveau cellulaire comme une superoxyde-dismutase, protégeant ainsi la cellule nerveuse contre l'action cytotoxique du prion pathogène [38b], comme indiqué sur le schéma 2 ci-après.

[e-]



Glutathion-peroxydase

(SeGpX)

Superoxyde-dismutase

(SOD)


H-O-O-H

Peroxyde d'hydrogène

H-O-H

Eau

.O-O.

.O-O-


Chaîne respiratoire (Mitochondrie)

Anion-superoxyde

Dioxygène




Catalase


Prion / Cu2+


Schéma 2

Principaux systèmes de défense contre les produits de réduction mono-électronique du dioxygène dans les mitochondries. (Rôle présumé du prion à cuivre, fonctionnant comme une superoxyde-dismutase).

I
La PrPc est codée par un gène PRNP, localisé chez l'Homme sur le chromosome 20. Ce gène qui code pour la protéine prion normal, possède un polymorphisme naturel au niveau du codon 129, qui correspond au facteur de risque majeur dans les maladies de Creutzfeldt-Jakob
l semble de plus en plus probable qu’une fonction importante de la protéine prion normal PrPc serait d’intervenir dans les mécanismes de défense cellulaire au niveau neuronal contre l’agression oxydante. Il y aurait libération au niveau cytoplasmique d’ions cuivriques qui seraient impliqués dans une voie de signalisation anti-oxydante de défense.

La PrPc est codée par un gène unique, le gène PRNP, qui chez l'Homme est localisé sur le chromosome 20.

Le gène PRNP possède un polymorphisme naturel au niveau du codon 129 qui ne peut coder que pour une méthionine (Met) ou pour une valine (Val). Or dans une protéine, l'interaction de deux méthionines ou de deux valines est souvent associée avec une conformation de type feuillet bêta.

Il semblerait donc que la méthionine ou la valine en position 129 joue un rôle important en modulant l'interaction moléculaire entre deux isoformes de la protéine prion.

Dans la population générale, 49 % des individus sont homozygotes (38 % Met/Met et 11% Val/Val) et 51 % sont hétérozygotes (Met/Val).

Les personnes homozygotes (Met-Met ou Val-Val) ont un risque de maladie de Creutzfeldt-Jakob sporadique, cinq fois plus élevé que celui des hétérozygotes (Met-Val). Si l'on compare les deux types d'homozygothie, le risque de MCJ sporadique pour les personnes Met-Met est deux fois plus élevé que pour les personnes Val-Val.

Dans la maladie de Creutzfeldt-Jakob sporadique, 68 % des personnes atteintes sont homozygotes (Met-Met) mais chez les malades touchés par la nouvelle variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, 100 % sont homozygotes (Met-Met) comme indiqué dans le tableau 1 çi-dessous.


Type de maladie de Creutzfeldt-Jakob

Homozygote

Hétérozygote

%

Met-Met

Val-Val

Met-Val

Caucasien - Normal

38

11

51

Maladie de Creutzfeldt-Jakob sporadique

68

15

17

Maladie de Creutzfeldt-Jakob iatrogène

11

67

22

Nouvelle variante (V-MJC)

de la maladie de Creutzfeldt-Jakob


100


-


-

Tableau 1

Influence du génotype porté par le codon 129

(D'après Nicole Le Douarin, Secrétaire perpétuelle de l'Académie des Sciences. La lettre de l'Académie des Sciences, n°1, p 6/2001) [56].
Dans les maladies de Creutzfeldt-Jakob sporadiques, l'homozygotie 129 Met/Met est un facteur de susceptibilité à l'infection. Par contre l'hétérozygotie 129 Met/Val a peut-être un rôle protecteur. De ce fait la sensibilité d'un individu à une maladie à prions apparaît être fortement sous contrôle génétique, comme du reste de nombreuses autres maladies infectieuses.


Le prion normal est synthétisé en quelques minutes dans les ribosomes du réticulum endoplasmique rugueux.
Le prion normal est synthétisé au niveau des ribosomes dans le réticulum endoplasmique rugueux, puis est modifié au niveau de sa partie glucidique dans l'appareil de Golgi.

Il est finalement transporté au niveau de la membrane plasmiqueil s'ancre sur la face externe grâce à l'enchaînement glycophosphatidylinositol (GPI) (formule page 23).

La proteine PrPc est ensuite internalisée par endocytose dans une vésicule d’endocytose (endosome) puis dans un endolysosomeelle est dégradée, comme l'indique la figure 4 [26b].





Membrane plasmique





Figure 4

Cycle de la Protéine Prion Normal PrPc dans une cellule eucaryote[26b].
Pour une part la protéine physiologique PrPc est dégradée dans le cytoplasme au niveau des protéasomes.

La protéine PrPc est formée dans presque tous les types cellulaires. Elle est principalement présente dans les neurones et à des concentrations beaucoup plus faibles dans les cellules gliales (cellules nourricières) du système nerveux central et dans certaines cellules du système immunitaire.

La PrPc, est, in vivo, synthétisée en quelques minutes mais est dégradée par les protéases comme la protéase K. Sa demi-vie est de 3 à 6 heures et celle de la PrPres est de plus de 24 heures (par exemple dans des cellules tumorales in vitro).
L
Les réelles fonctions physiologiques de la PrPc sont actuellement inconnues, mais un rôle dans la transmission synaptique est souvent invoqué [21].

es fonctions physiologiques de la PrPC ne sont pas connues pour l'instant, mais un rôle dans la transmission synaptique est souvent invoqué [32].Des travaux menés à l'Institut Pasteur et au CNRS montrent que la protéine prion participe au niveau neuronal à une cascade de signalisations qui active une enzyme tyrosine-kinase FYN, impliquée dans la régulation neuronale [33].

Par ailleurs les structures secondaires et tertiaires de la PrPc ne sont pas totalement établies par suite des difficultés à réaliser une analyse cristallographique précise sur les protéines PrPc animales.

Pour l’heure, la seule protéine prion dont la structure a été déterminée au niveau moléculaire est la protéine prion recombinante (rPrP) produite par E.coli et repliée in vitro.

Le problème actuel est lié à la détermination de la nature exacte de l'agent infectieux. Pour certains, la protéine mal repliée est à elle seule l'agent infectieux; pour d'autres elle serait associée à un agent infectieux encore inconnu. En théorie, le prion pourrait exister sous deux formes liées à son mode de repliement (folding protein) : une forme normale la PrPc et une forme anormale la PrPres, qui a la possibilité, lorsqu'elle est introduite dans une cellule de favoriser le mauvais repliement des formes normales qui y préexistent [34].


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