Entente préalable aux projets Roche-NimbleGen
télécharger 25.1 Kb.
|
 UMR INRA 116 -UEVE-ERLCNRS 8196 Entente préalableaux projets Roche-NimbleGenTiling Arabidopsis Informations générales et conditions d’accèsL’accès aux puces Tiling array Arabidopsis Roche-NimbleGen pour des projets d’analyse du transcriptome ou Chip_chip est possible dans le cadre de partenariats entre l’URGV et d’autres laboratoires, dans la mesure des ressources produites à l’URGV. Pour bénéficier de cette prise en charge, les équipes intéressées établiront une demande à transmettre à Sandrine Balzergue (URGV) par mail (balzerg@evry.inra.fr). Les commandes des lames NimbleGen, la préparation des cibles et hybridations seront effectués par le personnel dédié de la plateforme. L’équipe apporte son savoir faire sur les analyses du transcriptome et sa main d’œuvre dans cette collaboration mais ne dispose pas de ressources financières propres pour prendre en charge le coût des consommables qui seront donc facturé au laboratoire partenaire, soit 215€ HT/hybridation. Un DVD contenant tous les fichiers relatifs au projet, dont les données brutes et analysées, sera transmis aux laboratoires partenaires. Les résultats des expériences seront intégrés dans la base de données CATdb (compatible avec le standard MIAME : Brazma et al, 2001. Nat Genet. 29(4):365-71) et transmis à la base de données Geomnibus du NCBI pour la publication. Il vous sera donc demander de remplir un fichier concernant les informations relatives à votre projet (de la question biologique à la préparation de vos échantillons). Les données seront rendues publiques 1 an maximum après la fin du projet, un mail vous en informera 15 jours avant. A cette même date, les échantillons d’ARN et les ARN amplifiés restant vous seront renvoyés. Les données techniques (protocoles etc.) ainsi que la liste des collaborations en cours sont consultables sur le site web de l’URGV : http://www.versailles.inra.fr/urgv/microarray.htm Caractéristiques des lames et productionLe support Roche-Nimblegen Tiling array est composé de 3 chambres indépendantes sur une même lame contenant chacune 720.000 oligos représentant le tiling complet (en Reverse ou en Forward) du génome d’Arabidopsis. Chaque oligos a un pas de 165 nucleotides en moyenne ; le Tm de l’ensemble de la chambre est homogène et est de 76° +/- 2°C. La longueur des oligos varie entre 50 et75 nt, la moyenne étant de 55 nt. L’URGV se charge de faire produire le nombre de lame Tiling nécessaire à votre projet. Préparation des échantillonsIl est important de noter que de nombreux facteurs influent sur le niveau d’expression des gènes d’une plante. Le contrôle des conditions expérimentales est donc crucial si l’on veut relier une différence d’expression à la fonction étudiée. Ainsi une plante témoin comparée à une plante ayant subi un traitement spécifique devra être cultivée dans le même environnement nutritionnel et lumineux que cette dernière. Par exemple, un décalage de récolte en cours de journée révèlera des différences dues à l’expression circadienne de nombreux gènes. Un défaut d’homogénéité d’arrosage ou de traitement phytosanitaire peut être source de variabilité sans rapport avec le processus étudié. Ces considérations sont à prendre en compte pour assurer la reproductibilité des échantillonnages. RépétitionsIl est essentiel de faire la différence entre une répétition technique et une répétition biologique. Voici les principales caractéristiques de chacune d’elle. Répétitions techniques : Les répétitions d’un échantillon sont préparées au même moment (semis, prélèvements, extractions …). Permet l'observation et la quantification des biais techniques (variabilité technique). Contrôle de la reproductibilité des études. Contrôle de la qualité des données obtenues. Les conclusions ne sont valables que pour l'individu. Répétitions biologiques : Les répétitions d’un échantillon sont préparées à des moments différés dans le temps (semis, prélèvement, extraction …) avec au minimum 24h de décalage (attention au cycle circadien). Permet l'observation de la variabilité inter-individus. Les conclusions sont généralisables aux populations étudiées. En tout état de cause, il est nécessaire de prévoir au moins une répétition biologique, c’est-à-dire une répétition de l’ensemble de l’expérience. L’objectif étant de caractériser la variabilité biologique entre les répétitions, et de « l’éliminer » afin d’identifier les gènes dont la différence d’expression est liée au seul facteur étudié. Nous réalisons systématiquement un « dye-swap », soit une répétition technique pour éliminer les biais de marquages. Sur un couple de lames, nous hybridons deux échantillons marqués en inversant les fluorochromes. Exemple : - lame 1 : contrôle Cy3 – traitement Cy5 - lame 2 : traitement Cy3 – contrôle Cy5 Quantité et qualité du matériel nécessaire aux expériences Une quantité de 4µg d’ARN total (concentration minimale de 200ng/µl) par échantillon est à prévoir. En effet nous procédons à une étape de transcription in vitro avec la polymérase de T7 (pour information : comme dans le protocole Affymetrix), ce qui permet de produire suffisamment de cRNA pour plusieurs comparaisons. La pureté des ARN étant un des facteurs les plus importants pour la réussite de l’expérience, il est préférable d’utiliser un protocole d’extraction sur colonne (type RNeasy) en incluant l’étape de DNase I. Pour les échantillons « difficiles » comme les graines, l’ajout de PVP s’avère très utile, nous contacter si besoin. Les ARN totaux sont envoyés en carboglace dans la solution d’élution. Leur qualité sera estimée sur puce Agilent et ils seront dosés au « Ribogreen » après leur arrivée sur la plateforme.L’envoi des ARN par les collaborateurs sera accompagné du tableau d’informations dument rempli (à imprimer en dernière page).Processus opérationnel
Après analyse statistique des résultats bruts, une liste de gènes par comparaison (dye-swaps) est produite. Elle comprend le log2 moyen des intensités, le log2 des ratios moyens normalisés, ainsi que les p-value par gène. Publication des résultatsIl s’agit de collaborations scientifiques entre l’URGV et le partenaire, dans laquelle la plateforme apporte son expertise. Seul le coût des consommables est pris en charge par le laboratoire partenaire. A ce titre, au moins un membre de la plateforme sera signataire de la première publication dans laquelle les données de transcriptome seront présentées/exploitées. Il vous sera également demandé de cité dans le texte de description des données, la base de données CATdb (par exemple : « All raw and normalized data are available through the CATdb database (AU_XXXXXXX, Gagnot et al, 2008) and from the Gene Expression Omnibus (GEO) repository at the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (T. Barrett et al. NAR 2006) : accession number GSE XXXXX.»). Document descriptif du projet à fournirNous vous demandons un descriptif avec ces rubriques à remplir : 1 - Titre du projet 2 - Nom et coordonnées du responsable du projet 3 - Nom et coordonnées de la personne chargée du suivi des analyses en liaison avec l’URGV 4 - Objectifs scientifiques 5 - Plan d’expérience 6 - Nombre de lames – description des échantillons par lame (organe, stade de prélèvement selon Boyes et al . Plant Cell 2001, traitement…) 7 - Date prévue de fourniture des échantillons à l’URGV ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 8 - Tableau à joindre aux échantillons d’ARN lors de l’envoi :
Version du 28/07/2011 Page / |
similaire:
 | | ||
|  | «l’éliminer» afin d’identifier les gènes dont la différence d’expression est liée au seul facteur étudié | |
| «l’éliminer» afin d’identifier les gènes dont la différence d’expression est liée au seul facteur étudié | | «Je Crée» servira de support aux porteurs de projets et aux réseaux d’accompagnement du Nord Pas de Calais |
| | «réellement communautaire»), les facteurs associés à leur présence (notamment l’exposition préalable aux antibiotiques) et sur ses... | |
| |