Cours de Laurence Dupont I le monde microbien





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Microbiologie et génie génétique

D’après le cours de Laurence Dupont


I) Le monde microbien
1) La diversité du monde microbien
Les trois domaines du vivant :

Eucaryotes (plantes, champignons, animaux)

Archaea (Sulfolobus, Methanogènes, Halophiles)

Bacteria



Microorganismes : 4 grands groupes :

  • Procaryotes = BACTERIA + ARCHAEA

  • Champignons = Unicellulaires (levures)

Pluricellulaires (moisissures)

  • Algues

  • Protozoaires = PROTISTES


Ce sont les Archeobactéries que l’on trouve dans les milieux les plus hostiles. Leur ADN ne sera pas en fusion à 100°C, donc ce sont des organismes interessants à etudier d’un point de vue biotechnologique.
Les virus ne sont pas vivants. Ils sont incapables de se procréer de manière autonome. Ce sont des parasites obligatoires.
On trouve les bactéries surtout dans le sol et l’eau. Elles se retrouvent en grande concentration dans les organismes Eucaryotes, le corps humain est constitué de presque plus de bactéries que de cellules humaines.


Les microorganismes sont les pionniers de la vie sur Terre. L’apparition de l’oxygène est due au fait que des bactéries deviennent aptes à effectuer la photosynthèse, les Cyanobactéries. Elles colonisent les milieux extrêmes. Ce sont les ancêtres des organites Eucaryotes.

A l’origine des mitochondries, il s’agit d’une bactérie qui aurait envahit une cellule Eucaryote. Les chloroplastes de la même maniere. C’est la théorie endosymbiotique.
2) Caractères généraux des Procaryotes – Eucaryotes
Points communs




Eucaryotes

Procaryotes

Cytoplasme (Cytosol)

oui

oui

Matériel Génétique

oui

oui (masse fibreuse, un seul chromosome circulaire)

Membrane (cyto)plasmique

oui

oui


Différences

Noyau (+Membrane nucléaire)

oui

non

(Voir tableau 1.3)
Une bactérie fait environ de 0,5 à 1µm de long. Une cellule Eucaryote fait de 5 à 20µm.

Les Procaryotes ont une reproduction de type asexué (clonale). Ils se divisent par scissiparité (division binaire).
3) La microbiologie d’hier et d’aujourd’hui
Effet des maladies sur la civillisation :


  • 565 : Déclin de Rome : Peste bubonique, variole

  • Moyen-âge : Epidémies de typhus, peste, variole, syphilis, choléra

  • 1346 : Chine (Route de la Soie) : Epidémies de peste bubonique

  • 1720-1722 : Epidémies de peste en France

  • Défaites napoléoniennes : Moscou 1812 et Leipzig 1813 : Typhus, pneumonie, dysenterie


Avant 1650 : période sombre (476-1000)

Miasme, être suprême, magie, génération spontannée.. ?

De 1650 à 1850 : remise en question des doctrines traditionelles (Période des lumières)
1) Les 1ers microscopes = 1650

- A. Van Leeuwenhoek (1632-1723) : 1ère description de bactéries.

- R. Hooke (1635-1703) : notion de cellules individuelle.
2) Contestataires de la doctrine de la génération spontanée

- F. Redi

- L. Spallanzani

- F. Schulze

etc..
3) La microbiologie apres 1850 : période moderne

  • Louis Pasteur (1822-1895) : Stérilisation, fermentation de la bière, maladies infectieuses (rage).

  • L’école de Koch (1843-1910) et Coll : Anthrax, notion de colonie, culture pure. Outils microbiologistes. Isolement de micro-organismes pathogènes responsables de nombreuses maladies.

  • Rôle des micro-organismes dans les cycles de la matière : M. Beijerinck (1851-1931). S. Winogradsky (1856-1953).


Microbiologie = Organismes modèles en recherche fondamentale pour études de :
Nutrition

Métabolisme

Génétique

Biochimie
Biotechnologie microbienne : Pour quels secteurs ?
- Production d’aliments et de boissons (bière, vin, pain, produits laitiers,...)

- Additifs alimentaires (alcools, acides aminés, acides, polysaccharides, vitamines,...)

- Agriculture (plantes transgéniques, biopesticides)

- Pharmaceutique (antibiotique, stéroïdes, vaccins, peptides, hormones,...)

- Environnement (traitement de l’eau usée, de l’air et des sols pollués, bioextraction des minerais, biocapteurs,...)

- Spécialités diverses : industrie de la pâte à papier, biotensioactifs, biocosmétiques, biomatériaux, biocapteurs,...
II) Nutrition et croissance des micro-organismes
Nutrition dans le règne du vivant :
Plantes : Elles tirent l’energie de la lumiere et ont besoin de CO2 pour le carbone.

Animaux : Ils tirent l’énergie et le carbone des molécules organiques (bactéries, animaux, végétaux).

Micro-organismes : Photosynthétiques et/ou utilisation de molécules organiques.

Ils ont une diversité métabolique différente des animaux et des végétaux.
On pense que pour chaque molécule carbonée naturelle qui existe à la surface de la planète, il existe un micro-organisme capable de la métaboliser, même pour le cyanure, les hydrocarbures, le TNT (Trinitrotoluène), le benzène, ...
Il y a une grande diversité métabolique d’une espèce à une autre. Certaines ne sont capables d’utiliser qu’un composé carbonné, tandis que d’autres peuvent en utiliser jusqu’à une centaine de différents. La nutrition chez les procaryotes est un processus par lequel les microorganismes puisent et utilisent les aliments pour produire à la fois de l’energie et des matériaux de structure.
Voir tableau 5.1
Comment constituer un milieu adéquat à la culture d’un micro-organisme ? Il va être basé sur les éléments présents dans un micro-organisme. A 90% une bactérie est composée d’eau. Le reste est représenté sur le tableau. Il y a surtout C, O, N, H, le reste étant des sels minéraux.
1) Les besoins nutritifs courants
a) Les macroéléments (95% du poids sec de la cellule).

- C, H, O sous forme de glucose, N sous forme de (NH4)Cl, P sous forme de PO42-, S sous forme de (SO4)Mg en (g/L)

- K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+ (mg/L)
b) Les microéléments (ou oligoéléments)

- Mn, Zn, Co, Cu, Ni, Mg (µg/L)
c) Les facteurs de croissance

- Vitamines

- Bases puriques et pyrimidiques

- Acides aminés
Les bactéries prototrophes de type sauvage poussent sans facteurs de croissance.

Les bactérie auxotrophe de type mutant poussent seulement en présence de facteurs de croissance.

Ex : Une bactérie auxotrophe vis à vis de la leucine (leu-) est incapable de synthétiser la leucine (mutation dans la voie de biosynthèse de cet AA).

 Cet élément doit être rajouté dans le milieu de culture.
2) Entrée des nutriments dans la cellule bactérienne
Il n’y a pas d’endocytose chez les Procaryotes.

On a une membrane cytoplasmique contituée d’une bicouche phospholipidique, comme chez les Eucaryotes. Elle est hydrophobe, donc hautement selective. L’eau s’y diffuse librement, ainsi que plus ou moins alcools et acides gras.

Par contre, toutes les molécules polaires (ions, acides aminés, sucres..) ne diffusent pas.
Dans la niche écologique, la concentration en nutriments dans le milieu extérieur est très faible. Il faut que cette concentration en nutriments soit 100 à 1000x supérieure à l’intérieur du procaryote pour permettre sa croissance. Plusieurs cas de figure pour y arriver :
a) Transport passif (selon le gradient de concentration)



  • Diffusion passive.


La bactérie n’a pas besoin de dépenser d’énergie sous forme quelconque.


  • Diffusion facilitée (perméase membranaire)


A faible concentration, la diffusion facilité permet d’avoir une entrée plus importante que la diffusion passive. On arrive à une phase plateau, où on arrive à un équilibre : une protéine membranaire interne à la membrane cytoplasmique est utilisée, la perméase.

Les interactions du substrat avec la perméase changent sa conformation et ceci va permettre la libération du nutriment à l’intérieur de la membrane.

Il existe plusieurs perméases qui possèdent une spécificité d’affinité, qui sera plus ou moins grande en fonction du substrat.
Lorsque que la concentration du substrat sera trop importante on va arriver à une saturation, car toutes les protéines seront occupées.

b) Le transport actif (contre le gradient de concentration, nécessite de l’énergie)
Lorsque la concentration en nutriments est plus importante à l’intérieur de la bactérie qu’à l’extérieur :

Il permet, en consommant de l’energie, de faire passer un soluté du coté de la membrane où il est le moins concentré pour augmenter sa concentration de l’autre côté de la membrane. Des ions passent contre un gradient de concentration en utilisant de l’energie.


  • ATP : Système de transport ABC (ATP Binding Cassette)



Système de transport utilisant les protéines capables de lier l’ATP. Elles se trouvent dans différents endroits selon la bactérie. Chez les bactéries Gr+ elle est intrinsèque. Chez les Gr- elle est libre dans le périplasme. Les perméases membranaires sont en général présentes à deux copies. Elles sont hydrophobes.

La protéine ATPase est coté cytoplasme mais intéragit avec la membrane.
La différence de charge qui existe de part et d’autre de la cellule est due à un phénomène établi au cours du transport des électrons au travers de la membrane plasmique.

Les organismes respirent de manière aérobie ou anaérobie. Le milieu extérieur est chargé positivement, le milieu intérieur est chargé négativement.

Conséquence : ces forces électrochimiques et protomotrices vont servir à permettre la synthèse d’ATP, et à faire du transport de substrat.


  • Force proton-motrice :


indirecte : gradient électrochimique.

Dans les systèmes antiport, ces systèmes vehiculent deux molécules différentes dans les sens opposés (exemple : antiport Na+/H+).
directe : antiport H+/Na+, symport H+/sucre ou AA.Grace a ce syteme d’antiport, on va avoir un gradient de Na+. Le sodium va avoir tendance à rerentrer et les symports vont utiliser cette force. Ils déplacent deux substances différentes dans le même sens. Exemple : cotransporteur sucre/Na+.
indirecte : gradient de Na+ du à l’antiport H+/Na+, symport Na+/sucre ou AA.
c) La translocation de groupe : cas du système PTS (PhosphoTransféraseSystem)
N’a pas son équivalent chez les Eucaryotes. Ces systèmes servent au transport des sucres. (Chez Escherichia coli, le glucose rentre par ce système).

L’energie est amenée par la liaison hautement énergietique du phospho-énol-pyruvate. L’hydrolyse de cette liaison permettre de faire rentrer le sucre de l’extérieur vers l’intérieur de la membrane. Au cours du transport le glucose sera phosphorylé (glucose6P).
Cette réaction fait appel à 4 enzymes différentes (E I et HPr, dans protéines solubles dans le cytoplasme, E III périphérique à la membrane cytoplasmique, et E II intrinsèque).

La première enzyme va s’autophosphoryler, le groupement phosphate va se transferer de proche en proche jusqu’à la membrane et va conduire à la phoshorylation du sucre qui va pouvoir rentrer.

d) Transport du fer via sidérophores
Le fer est un composant essentiel des cytochrones et des protéines Fer-Soufre, servant au transport des électrons dans la respiration. Le fer naturel est Fe3+. Ainsi il est insoluble, donc intransportable. Les micro-organismes sécrètent des agents chélateurs de bas poids moléculaire appelés sidérophores dans le milieu extérieur lorsque leur concentration en fer va baisser. Ces sidérophores vont fixer le fer et se fixer sur un recepteur membranaire spécifique et faire rentrer le fer dans la cellule.
Animations des transports sur http://www.ac-creteil.fr/biotechnologies/doc_transportmb.htm

3) Culture des micro-oganismes
A) Les différents milieux de culture


  • Milieux synthétiques ou définis ou minimums : on connait tous les éléments (nature et concentration). Dans un milieu minimum vont pousser des bactéries peu exigeantes (prototrophes) : on met une seule source de chaque élément requis (C, N, S, P, Ca2+, K+, Mg2+ et oligoéléments). Ces bactéries vont synthétiser leurs acides aminés.




  • Milieux riches ou complexes : ni la composition ni la concentration ne sont connues. Dans ces milieux vont pousser les bactéries auxotrophes, qui exigent des facteurs de croissance (AA, vitamines, bases azotées).


On peut rajouter des peptones (hydrolysat protéolytique de protéines) ou de la Trypsine (hydrolysat trypsique de protéines), de l’extrait de boeuf (AA, nt, Acides organiques, vitamines et minéraux) et/ou de l’extrait de levure de bière (C, N, vitamine B). Certaines bactéries recquierront du sang, du sérum...
On met ces bactéries dans un milieu liquide ou solide (en ajoutant de l’agar à 15g/L) et on stérilise par autoclavage.
B) Les types de milieux
- Milieu sélectif ou d’enrichissement : enrichir la croissance de la bactérie recherchée parmi une population mixte très dense.
Ex1 : Milieu Mc Conkey (sels biliaires, cristal violet)  Gram- intestinales.

Ex2 : Milieu minimum avec cellulose (au lieu de glucose, seule source de carbone)  Bactéries hydrolysant la cellulose.

Ex3 : Milieu + antibiotique (anti-G+ ou G-, anti-fongiques,...).
- Milieu différentiel : distinction à l’oeil nu.
Ex : Gélose au sang  bactéries hémolytiques ou pas (destructrices de globules rouges).
- Milieu de conservation : On peut conserver les souches de bactéries à -110°C.
C) Isolement d’une culture pure : méthode des stries.
On part d’un mélange et on obtient une souche pure. Animation sur http://www.ac-creteil.fr/biotechnologies/doc_streakplate.htm.
4) La croissance des micro-organismes


  1. Discontinu ou en bactch (système fermé, pas d’apport de milieu frais).

  2. Culture continue ( système ouvert, remplacement continu du milieu).


Physiologie de la croissance dans ces conditions est connue et cette croissance peut être décrite mathématiquement.
A) Mesure de la croissance
1) Mesure du nombre de cellules
On va mesure la division bactérienne. La croissance revient à dénombrer le nombre de cellules à la fin de la culture. Différentes façon :
a) Titrage (nombre de cellules viables)
On a un échantillon initial qu’on dilue par séries de 10 en 10 :


On l’étale sur un milieu gélosé de dilutions appropriées (0.1 mL). On incube.


Une cellule = une colonie = 106
b) Comptage direct
Chambre de petroff-Hausser. Utilisé pour les levures car elles sont suffisament grosses pour le comptage. On a une lamelle creuse où on dépose un champ precis et on denombre les cellules observées.
c) Compteur électronique
Compteur de Coulter. On a un flux où les cellules passent une par une et un detecteur relié à un compteur va compter les cellules.
2) Mesure de la masse cellulaire
Pour les mycètes, cultures de volume supérieur à 100 mL :

* Poids sec (par deshydratation ou centrifugation)

* Poids frais
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