UNIVERSITE BLAISE PASCAL – CLERMONT II
Année 2002 N° D’ORDRE :
THESE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE CLERMONT II
Discipline :
Physiologie et Génétique Moléculaire
présentée et soutenue publiquement
par
Frédéric NORRE
Le 25 Octobre 2002
Titre :
REGULATION TRANSCRIPTIONNELLE DU PROMOTEUR HMWG-DX5 DE BLE
DANS L’ALBUMEN DE MAÏS
ET CREATION DE PROMOTEURS CHIMERIQUES.
Directeur de thèse : Docteur Véronique GRUBER
JURY
Professeur Joël DREVET, Université CLERMONT II Président
Docteur Michel DELSENY, Directeur de Recherche CNRS PERPIGNAN Rapporteur
Professeur Francis QUETIER, Directeur Général Adjoint du Génoscope Rapporteur
Docteur Dolores LUDEVID, Directeur de Recherche CSIC BARCELONE Examinateur
Professeur Jean-Marc DERAGON, Université CLERMONT II Examinateur
A vous deux.
Remerciements
Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à Bertrand MEROT (Président du directoire de MERISTEM Therapeutics), pour m’avoir accueilli dans son entreprise.
Je remercie Manfred THEISEN (Directeur scientifique) pour m’avoir intégré dans son équipe de recherche et pour l’intérêt qu’il a porté à l’égard de mon travail et de son bon déroulement.
Je remercie très sincèrement Véronique GRUBER (Directeur de thèse) pour ses précieux conseils et son entière disponibilité. Je te suis infiniment reconnaissant pour la confiance que tu m’as accordée et les nombreuses responsabilités que tu as su me faire partager.
Je remercie Joël DREVET pour avoir accepté d’être mon correspondant universitaire dans le cadre de la convention CIFRE et pour l’intérêt qu’il a porté à mon travail malgré ses nombreuses occupations.
Je suis très sensible à l’honneur que me font Mr Michel DELSENY et Mr Francis QUETIER de juger ce travail, ainsi que Mme Dolores LUDEVID, Mr Joël DREVET et Mr Jean-Marc DERAGON pour leur examen critique de ce travail.
Je remercie Dolores LUDEVID pour m’avoir accueilli périodiquement dans son laboratoire du CSIC de Barcelone et m’avoir fait partager les compétences scientifiques de son équipe.
Je remercie Pau MARZABAL pour son soutien moral que j’espère réciproque à l’aube de nos soutenances et pour son esprit critique au combien précieux à l’égard de mon travail.
J’exprime toute ma sympathie à mes collègues de l’équipe de biologie moléculaire qui m’ont aidé et soutenu dans ce travail. Je remercie Laurent BEUF que je n’arrive pourtant pas à convertir en supporter du Clermont Foot, Franck CHANTELOT pour les longues discussions que nous avons eu sur « les éléments cis et les facteurs trans » ; David COMEAU que j’ai souvent ennuyé avec mes questions « radioactives », Laurent PARRY notre auvergnat national, Iann RANCE et son Floc de Gascogne, Virginie JONVAL et Cécile MERLE pour leurs sourires au combien importants dans cette équipe de « mecs ». Je remercie Stéphane MAGROT pour sa collaboration et son « opposition » au Squash. Je remercie également très vivement Sancha SALGUEIRO et Daniel BURTIN.
Je remercie très sincèrement mes collègues des équipes de biologie cellulaire, de production végétale et de propriété intellectuelle qui se sont beaucoup investis dans le cadre du projet « promoteurs de sur-expression ».
Je remercie tous mes collègues des équipes de biochimie, d’extraction purification et des services généraux ainsi que ceux de l’ensemble des départements de MERISTEM qui, par leur aide ou leur amitié ont largement contribué à la réalisation de cette thèse.
Ma plus grande reconnaissance s’adresse à mes parents et à mes grands-parents qui m’ont encouragé et soutenu sans relâche tout au long de mes études.
Un grand merci à Sylvaine et à Gabriel pour tout le bonheur qu’ils m’apportent.
LISTE DES ABRÉVIATIONS
Les unités de masse, de longueur, de volume, de concentration, de temps, de températures et de pression employées dans ce manuscrit sont celles du système international des mesures des grandeurs physiques. Les symboles des composés chimiques du tableau périodique des éléments ont également été utilisés. Enfin, il a été fait usage des abréviations suivantes.
ABA : acide abscissique
ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
ADNds : ADN double brin
ADN-T : ADN de transfert
ARN : acide ribonucléique
ARNm : ARN messagers
ASF-1: “activating sequence factor 1”
bar : bialaphos résistance
bZIP : leucine zipper basic
BSA : sérum albumine bovine
CaMV : « cauliflower mosaic virus » (virus de la mosaïque du chou-fleur)
DAP : « Day After Pollination » (jours après pollinisation)
dNTP : désoxyribonucléotides 5’-triphosphate
DO : densité optique
DOF : “DNA binding with One Finger”
DTT : dithiothréitol
E. coli : Escherichia coli
EDTA : acide éthylène diamine tétra-acétique
EMSA : « electrophoretic mobility shift assays » (retard de migration sur gel)
E35S : « enhanced 35S » (promoteur double 35S du CaMV)
GARE : element de réponse à l’acide gibbérellique
GLM : GCN-4 « like » motif
GUS : -glucuronidase
GUS-INT : GUS intron
HMG : « High Mobility Group »
HMWG : « High Molecular Weight Glutenin » (glutenine de haut poids moléculaire)
kb : kilobase
LB : Luria-Bertani
LMW : « Low Molecular Weight » (faible poids moléculaire)
LUC : luciférase
MCP : mort cellulaire programmée
MS : Murashige et Skoog
O2 : opaque-2
O/N : “over night”
pb : paire de bases
PBF : « P-box binding factor » (facteur de liaison à la boîte prolamine)
Pb : « prolamine-box » (boîte prolamine)
PCR : « polymerase chain reaction » (réaction de polymérisation en chaîne)
PNV : volume nucléaire du culot
p/v : poids/volume
RER : réticulum endosplasmique rugueux
RLU : unité relative de lumière
rpm : rotation par minute
SA : acide salicylique
SDS : sodium dodécyl sulfate
SOE : « splicing overlap extension » (extension PCR par chevauchement)
TBE : tris borate EDTA
UP : ultra pure
UV: ultra violet
v/v : volume/volume
wt : « wild-type » (ligné sauvage)
REGULATION TRANSCRIPTIONNELLE DU PROMOTEUR HMWG-DX5 DE BLE DANS L’ALBUMEN DE MAÏS ET CREATION DE PROMOTEURS CHIMERIQUES.
Résumé :
La région promotrice proximale du gène Glu-1D1 de gluténine de haut poids moléculaire de blé (PrHMWG-Dx5) porte une boîte albumen bifactorielle atypique qui comprend un motif G « like » (5’-TTACGTGG-3’) situé en amont d’une boîte prolamine (Pb1, 5’-TGCAAAG-3’). Les tests d’expression transitoire dans l’albumen de maïs indiquent que le fragment promoteur minimal contenant au moins la boîte G « like » est nécessaire et suffisant pour une activité maximale de PrHMWG-Dx5. Dans le maïs transgénique, nous avons montré que la séquence de 89 pb qui contient la boîte albumen bifactorielle se comporte comme une unité cis-activatrice fonctionnelle. Sa répétition en tandem direct confère un effet activateur additif puissant spécifique de l’albumen. En contraste, l’association des séquences activatrices as-1 et as-2 du promoteur 35S du CaMV avec des séquences promotrices dérivées de PrHMWG-Dx5 dérégule son activité dans les plants de maïs et de tabac. Par la technique de retard de migration, nous avons démontré que la boîte G « like » peut fixer deux groupes de protéines qui ont respectivement la même affinité de liaison à l’ADN que les facteurs de transcription de la famille Opaque-2 et de la famille ASF-1. Nos résultats nous conduisent à proposer un modèle hypothétique qui repose sur une dualité fonctionnelle de la boîte G « like » dans l’albumen des céréales, et suggère son implication potentielle alternativement dans la synthèse des protéines de réserve et dans la réponse de défense de la plante.
Mots Clés : Albumen de maïs
Promoteurs chimériques
HMWG-Dx5
Boîte albumen bifactorielle
Facteurs de transcription
Réponse de défense des plantes
TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF WHEAT HMWG-Dx5 PROMOTER IN MAIZE ENDOSPERM AND CREATION OF CHIMERIC PROMOTERS.
Abstract:
The proximal region of the high molecular weight glutenin promoter of the Glu-1D1 gene (PrHMWG-Dx5) carries an atypical bifactorial endosperm box containing a G-box like motif (5’-TTACGTGG-3’) followed by a prolamin-box motif (Pb1, 5’-TGCAAAG-3’). Transient expression assays in maize endosperm indicate that a promoter fragment containing at least the G-box like element is necessary and sufficient for maximal expression of the HMWG-Dx5 promoter. In transformed maize, we have shown that a 89bp sequence bearing the bifactorial endosperm box behaves like a functional cis-acting unit. Its direct tandem repetition confers a strong specific additive effect in endosperm tissue. In contrast, the fusion of the activation sequences as-1 and as-2 of the CaMV 35S promoter with PrHMWG-Dx5 derived sequences deregulates its activity in transformed maize and tobacco. Using gel mobility shift assays we have demonstrated that the G-box like motif binds two protein groups, which respectively, have the same DNA binding affinities as transcription factors of either the O2 family or the ASF-1 family. Our results lead us to propose a hypothetic model which is based on a functional duality of the G-box like element in cereal endosperms, and suggests its potential alternative implication in storage protein synthesis and in plant defense response.
Key words : Maize endosperm
Chimeric promoters
HMWG-Dx5
Bifactorial endosperm box
Trans-acting factors
Plant defense response
SOMMAIRE.
INTRODUCTION. 9
I. Le grain de maïs. 12
II. Régulation de l’expression des gènes zéines. 20
III. Projet de thèse. 27
MATERIEL BIOLOGIQUE 29
I. Le matériel végétal. 29
II. Les souches bactériennes. 30
III. Les plasmides d’expression transitoire. 31
IV. Les plasmides binaires. 36
V. Le domaine de liaison à l’ADN natif et muté de la protéine PBF. 37
METHODES 38
I. Analyses des acides désoxyribonucléiques. 38
II. Transformation transitoire du matériel végétal. 45
III. Transformation stable du matériel végétal. 48
IV. Méthodes d’analyses relatives aux protéines. 49
V. Expériences de retard de migration sur gel. 51
RESULTATS & DISCUSSION 54
I. Description des séquences promotrices dérivées de PrHMWG-Dx5. 54
II. Activité des promoteurs synthétiques dérivés de PrHMWG-Dx5 dans le maïs. 60
III. Activité des promoteurs chimériques dérivés de PrHMWG-Dx5 dans le tabac. 71
IV. Identification des interactions ADN-protéines potentiellement responsables de l’activité du promoteur HMWG-Dx5 et des promoteurs dérivés dans l’albumen de maïs. 76
DISCUSSION GENERALE. 83
I. Identification et caractérisation moléculaire d’éléments cis-régulateurs dans la séquence promotrice de PrHMWG-Dx5. 83
II. Effet cis-régulateur conféré par les séquences as-1 et as-2 du promoteur 35S du CaMV sur l’activité transcriptionnelle de PrHMWG-Dx5. 92
III. Modèle de régulation transcriptionnelle du promoteur HMWG-Dx5 dans l’albumen de maïs. 94
CONCLUSIONS & PERSPECTIVES. 96
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES. 99
ANNEXE.
TABLE DES MATIERES.
INTRODUCTION.
L’intérêt grandissant de l’industrie pharmaceutique pour la production de protéines possédant des propriétés thérapeutiques et les progrès en matière de génie génétique ont fait naître dans les deux dernières décennies un nouveau système de production de protéines recombinantes, connu sous le nom de « Molecular Pharming », qui utilise les plantes en tant que « bioréacteur » (Whitelam et al., 1993 ; Theisen, 1997 ; Deckers et al., 1999 ; Gidding, 2001). Le schéma général qui conduit à la production d’une molécule active dans les plantes, de l’adaptation du gène étranger à un système d’expression spécifique jusqu’à l’élaboration du médicament, est présenté dans la Figure 1. Ce système offre une alternative aux systèmes de production de types procaryotes, levures, cellules d’insectes, cellules de mammifères ou animaux transgéniques, lesquels pour des raisons éthiques, de coût ou de maturations post-traductionnelles des protéines, ne sont pas toujours adaptés (Fischer et al., 1999 ; Gruber et Theisen, 2000).
Dans le cadre d’une production de biomasse, les plantes transgéniques s’avèrent être une source de protéines recombinantes à faible coût et d’une grande sécurité pour l’homme vis à vis des contaminations virales et bactériennes (Mison et Curling, 2000). De nombreuses protéines recombinantes de mammifères ont été produites dans le tabac (Tableau 1), première espèce modèle qui a été transformée efficacement et régénérée (Horsch et al., 1985). La maîtrise croissante des techniques de transfert de gènes dans les espèces monocotylédones a permis d’envisager l’utilisation des grains de céréales comme organe de stockage des protéines recombinantes via le tissu de l’albumen. Outre des facilités de récolte et de stockage, les grains des céréales offrent un tissu de réserve naturel isolé de la partie végétative, qui limite les risques liés à une toxicité éventuelle de la protéine exogène pour la plante mère.
L’albumen du grain de maïs, lequel s’avère être un tissu de choix en terme de production des quantités importantes de protéines recombinantes (Tableau 1), est l’un des tissus cibles de MERISTEM Therapeutics, pour produire des protéines recombinantes à intérêt thérapeutique. La réussite du projet « Molecular Pharming », via l’utilisation du grain de maïs comme « bioréacteur », passe par la connaissance du grain de maïs et par le développement d’outils et de techniques performantes et innovantes capables entre autres d’améliorer le taux d’expression des protéines recombinantes produites dans l’albumen. Cette issue peut être envisagée à travers l’étude et la création de promoteurs de sur-expression pour augmenter l’activité transcriptionnelle, un des facteurs limitant qui influence le taux d’expression des protéines dans les plantes.
Bioréacteurs
|
Protéines et enzymes recombinantes
|
Taux d’expression *
|
Références
|
Feuilles et graines de tabac
|
Albumine humaine
|
0.02%
|
Sijmons et al. (1990)
|
Facteur de croissance épidermique
|
0.001%
|
Higo et al. (1993)
|
Erythropoïétine humaine
|
0.0026%
|
Matsumoto et al. (1995)
|
Hémoglobine humaine
|
0.05%
|
Dieryck et al. (1997)
|
Lactoferrine humaine
|
0,1-0,3%
|
Salmon et al. (1998)
Gruber et Spik (2000)
|
Collagène humain
|
100 mg/kg de tissu
|
Ruggiero et al. (2000)
Perret et al. (2001)
|
Lipase gastrique de chien
|
5% (rétention vacuolaire) et 7% (sécrétion)
|
Gruber et al. (2001)
|
Grains de maïs
|
Avidine
|
3%
|
Hood et al. (1997)
|
-glucuronidase
|
0.5%
|
Witcher et al. (1998)
|
Aprotinine
|
0.1%
|
Zhong et al. (1999)
|
Lipase Gastrique et lipase pancréatique de chien
|
ND
|
Roussel et al. (2002)
|
Tableau 1 : Liste non exhaustive des protéines et enzymes recombinantes produites dans le tabac et le maïs. (*) % de protéines extraites. ND, non déterminé.
|
