Remerciements
Je remercie ma directrice de thèse Marie-France Cesbron-Delauw pour l’encadrement de qualité qu’elle a assuré au long de ma thèse. La pertinence de ses idées scientifiques m’ont permis de contourner de nombreux obstacles expérimentaux, et ainsi de surmonter les moments de découragement.
Merci à tous les membres du jury qui ont accepté de juger mon travail, et spécialement aux rapporteurs, le Dr S. Méresse et le Pr C. Braun-Breton. Merci au Dr A. Dessen pour avoir accepté d’assurer la présidence du jury. Je remercie aussi le Dr M. Meissner qui a accepté de venir de loin pour éclairer mes résultats à la lumière de ses travaux sur les protéines de micronèmes.
Merci à tous les membres de l’équipe toxo du LAPM pour leurs conseils scientifiques et leur aide technique. Un merci spécial à Karine Musset sans qui tous ces travaux n’auraient pas été possibles… Merci aussi à l’ensemble du LAPM pour les bons moments partagés autour des pots d’anniversaire et autres…
Enfin, merci beaucoup à ma famille et à tous les amis qui m’ont soutenue au cours de ces trois ans. Une mention spéciale pour les amis informaticiens qui m’ont aidée à faire la mise-en-page de ce manuscrit jusque tard dans la nuit…
SOMMAIRE
1
Remerciements 2
SOMMAIRE 3
LISTE DES ABREVIATIONS 8
INTRODUCTION 9
I- Toxoplasma gondii : l’agent responsable de la toxoplasmose 9
I- 1- Cycle biologique 9
I- 2- Pathogénicité 11
I- 2- 1- Chez les sujets immunocompétents 11
I- 2- 2- Toxoplasmose de l’immunodéprimé 11
I- 2- 3- Toxoplasmose congénitale 11
I- 3- Etat actuel de la recherche anti-toxoplasmique 12
I- 3-1- Traitements existants 12
I- 3- 2 Vaccination 12
II-Toxoplasma gondii : une cellule infectieuse très compartimentalisée 14
II-1- Organisation subcellulaire du zoïte 15
II- 1- 1- La pellicule 16
II- 1- 2- L’apicoplaste 17
II- 1- 3- Le complexe apical 17
II- 1- 3- 1- Le conoïde et les anneaux 18
II- 1- 3- 2- Les micronèmes 18
II- 1- 3- 2- 1- Caractérisation moléculaire des protéines de micronèmes 19
II- 1- 3- 2- 2- Importance fonctionnelle des protéines de micronèmes 21
II- 1- 3- 3- Les rhoptries 22
II- 1- 3- 3- 1- Les protéines de rhoptries 22
II- 1- 3- 3- 2- Lipides contenus dans les rhoptries 23
II- 1- 4- Les granules denses, un organite caractéristique de T. gondii 24
II- 1- 4- 1- Les protéines de granules denses 24
II- 1- 4- 2- Fonctions des protéines de granules denses 26
II- 2- L’invasion et la formation de la vacuole parasitophore 28
II- 2- 1- Description morphologique de l’invasion 28
II- 2- 2- Mécanismes moléculaires de l’invasion 29
II- 2- 2- 1- Reconnaissance de la cellule-hôte 29
II- 2- 2- 2- Formation de la VP 30
II- 2- 2- 3- Maturation de la VP 31
III- Trafic subcellulaire des protéines de Toxoplasma gondii : 34
III- 1- Trafic dans le système sécrétoire précoce 34
III- 1- 1- Entrée dans le réticulum endoplasmique 34
III- 1- 2- Trafic entre le RE et l’appareil de Golgi 35
III- 2- Tri des protéines 38
III- 2- 1- Tri des protéines chez les eucaryotes supérieurs 38
III- 2- 2- Tri des protéines chez T. gondii 39
III- 2- 2- 1- Adressage aux granules denses 39
III- 2- 2- 1- 1- La voie par défaut pour les protéines solubles 39
III- 2- 2- 1- 2- Cas des GRAs transmembranaires 40
III- 2- 2- 2- Formation des micronèmes 40
III- 2- 2- 2- 1- protéines de micronèmes transmembranaires 40
III- 2- 2- 2- 2- protéines de micronèmes solubles 41
III- 2- 2- 3- Biogénèse des rhoptries 41
III- 3- Sécrétion des micronèmes, rhoptries et granules denses 45
III- 3- 1- Sécrétion des micronèmes 45
III- 3- 2- Exocytose des rhoptries 46
III- 3- 3- Sécrétion des granules denses : phénomène constitutif ou régulé ? 46
III- 4- Trafic post-sécrétoire chez T. gondii 48
III- 4- 1- Cas des protéines de micronèmes transmembranaires : insertion dans la MPP 48
III- 4- 2- Trafic post-sécrétoire des protéines de rhoptries 49
III- 4- 2- 1- Fusion de vésicules avec la MVP 49
III- 4- 2- 2- Adressage au noyau de la cellule-hôte 50
III- 4- 3- Association membranaire post-sécrétoire des protéines de granules denses 50
III- 4- 3- 1- Association aux membranes de la vacuole par des liaisons de type hydrogène 53
III- 4- 3- 2- Insertion dans les membranes du réseau 53
III- 4- 3- 3- Insertion dans la MVP 53
PROBLEMATIQUE et STRATEGIE 55
RESULTATS 59
I- Comparaison du trafic de GRA5 et de CD46 dans les deux systèmes d’expression Toxoplasme versus cellule de mammifère 59
I- 1- Expression de GRA5 en cellules de mammifères 59
I- 2- Expression de protéines de surface dans les parasites 63
I- 2- 1- Expression de CD46-TM CD46-CD46-HF dans les parasites 63
I- 2- 2- Expression de SAG1-TM CD46-CD46-HF dans les parasites 63
65
II- Etude de l’adressage de GRA5 aux GD 66
II- 1- Rôle des domaines peptide signal et C-terminal 66
II- 1- 1- Rôle du domaine PS dans l’adressage de GRA5 aux GD 66
II- 1- 2- Rôle du domaine Ct dans l’adressage et les propriétés biochimiques de GRA5 dans les GD 68
II- 1- 2- 1- Nécessité du domaine Ct de GRA5 dans ces processus 68
II- 1- 2- 2- Suffisance du domaine Ct de GRA5 dans ces phénomènes 69
II- 2- Rôle du domaine transmembranaire et du domaine Nt de GRA5 dans l’adressage soluble aux GD 72
II- 2- 1- Influence du TM dans le contexte du Nt SAG1 72
II- 2- 2- Influence du TM dans le contexte du Nt GRA5 74
II- 2- 2- 1- Résultats de transfection transitoire 74
II- 2- 2- 2- Résultats obtenus sur les clones stables 76
III- Etude de l’adressage sélectif des protéines GRAs dans la vacuole 78
III- 1- Adressage et insertion membranaire de GRA5 dans la MVP 78
III- 1- 1- Importance des domaines PS, TM et Ct dans ce phénomène 78
81
III- 1- 2- Importance du domaine Nt dans l’insertion membranaire post-sécrétoire de GRA5 82
III- 2- Adressage de GRA6 aux membranes du RNM 84
III- 2- 1- Suffisance du domaine Nt de GRA6 pour l’insertion dans les membranes du RNM 84
III- 2- 1- Nécessité du domaine Nt pour l’insertion membranaire post-sécrétoire de GRA6 86
III- 3- Fusions GRA5/GRA6 88
89
DISCUSSION et PERSPECTIVES 90
I- Comparaison des deux systèmes d’expression Toxoplasme versus cellule de mammifère 91
I- 1- Les propriétés particulières de sécrétion des protéines GRAs sont propres au parasite 91
I- 2- Vers l’identification d’une nouvelle voie pour l’adressage des protéines transmembranaires à la surface de T. gondii 93
II- Déterminants de l’adressage soluble de GRA5 aux GD 95
I- 1- Les domaines Nt et TM de GRA5 sont impliqués dans l’adressage aux GD 95
I- 2- Mécanismes permettant la solubilisation de GRA5 dans les GD : hypothèses 98
I- 2- 1- Solubilisation par interactions protéine-protéines 98
I- 2- 2- Solubilisation par interactions protéine-lipides 100
III- Adressage spécifique des GRAs TM aux différents systèmes membranaires de la VP 104
III- 1- Importance du domaine Nt dans ce processus 104
III- 2- Mécanisme(s) de l’insertion membranaire post-sécrétoire : hypothèses 106
III- 2- 1- Interaction du domaine Nt avec des partenaires protéiques 108
III- 2- 2- Hypothèse de l’insertion spontanée dans les membranes de la VP 109
III- 2- 3- Hypothèse de l’association des GRAs dans des microvésicules lipidiques solubles à 100,000 x g 110
CONCLUSIONS GENERALES 112
ANNEXE 114
MATERIEL ET METHODES 115
I- Techniques de biologie moléculaire 115
I-1- Vecteurs utilisés 116
I-1-1- Vecteurs de clonage 116
I-1-2- Vecteurs matrices 116
I-1-3- Vecteurs de co-transfection 116
I-2- Stratégie de clonage 117
1-2-1- Vecteurs destinés à être transfectés dans les parasites 117
1-2-2- Vecteurs destinés à être transfectés dans les cellules de mammifère 119
II- Techniques de biologie cellulaire 124
II-1 Culture des parasites et des cellules 124
II-2- Transfection, sélection et clonage de T. gondii 124
II-2-1- Transfection des parasites 124
II-2-2- sélection et obtention de transformants stables 125
II-2-3- Clonage des parasites sélectionnés 127
II-3- Transfection transitoire des cellules de mammifères HEK 293-T 129
III- Analyse de l’expression des protéines chimères 129
III-1- Analyses informatiques 129
III-2- Immunofluorescence (IF) 130
III-3- Techniques de fractionnement cellulaire 130
III-3-1- Fractionnement cellulaire de parasites extracellulaires 130
III-3-2- Fractionnement de cellules infectées 131
III-3-3- Fractionnement des cellules HEK 293-T 131
III-4- Séparation des protéines par électrophorèse SDS-PAGE et détection des protéines par immunoblot 132
BIBLIOGRAPHIE 134
RESUME 154
ABSTRACT 154
LISTE DES ABREVIATIONS
GD granules denses
VP vacuole parasitophore
MVP membrane de la vacuole parasitophore
RNM réseau de nanotubules membranaires
MPP membrane plasmique du parasite
EVP extensions de la vacuole parasitophore
HOST host organelles sequestering tubules
AES Antigènes d’excrétion-sécrétion
IMC complexe membranaire interne
JM jonction mobile
aa acides aminés
PS peptide signal
TM transmembranaire
Nt N-terminal
Ct C-terminal
RE Réticulum endoplasmique
TG trans-Golgi
LSP culot de centrifugation basse vitesse
LSS surnageant de centrifugation basse vitesse
HSP culot de centrifugation à haute vitesse
HSS surnageant de centrifugation à haute vitesse
S surnageant
P culot
I insoluble
D détergent
A aqueuse
NP-40 Nonidet P 40
IF immunofluorescence
INTRODUCTION
I- Toxoplasma gondii : l’agent responsable de la toxoplasmose
Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire qui a été identifié pour la première fois en 1908 par Nicolle et Manceaux dans le Nord de l’Afrique et par Splendore au Brésil. Le genre Toxoplasma appartient au phylum des Apicomplexa, qui comprend plus de 4500 espèces de parasites protozoaires différentes. Les pathogènes du genre Plasmodium (responsable de la malaria chez l’homme) ou Eimeria (responsable de coccidioses chez les aviaires) appartiennent également à ce phylum.
I- 1- Cycle biologique
Toxoplasma est capable virtuellement d’infecter et de se multiplier dans toutes les cellules nuclées mammifères ou aviaires. Son cycle biologique est divisé entre une phase de reproduction sexuée, qui ne peut s’effectuer que chez les félidés, et une phase de reproduction asexuée qui peut s’opérer chez tous les homéothermes, dénommés hôtes intermédiaires (Fig. 1). Pendant toute la phase de reproduction asexuée, le génôme de Toxoplasma est haploïde. Il contient 61.6 Mb répartis sur 14 chromosomes dont la taille varie entre 2 et 8 Mb. Parmi les formes de différentiation parasitaire rencontrées au cours du cycle, trois sont infectieuses (formes zoïtes):
la forme tachyzoïte, qui est la forme proliférative responsable de la dissémination parasitaire au cours de la phase aiguë de la Toxoplasmose. Les tachyzoites mesurent environ 5 µm de long sur 2 µm de large. Ils se multiplient à l’intérieur d’une vacuole parasitophore dans la cellule-hôte, avec un temps de génération de 6 à 8h. On peut trouver jusqu’à 128 parasites dans une même vacuole, qui s’élargit jusqu’à la lyse cellulaire. Les parasites libérés vont ensuite infecter une cellule voisine.
La forme bradyzoïte, caractéristique de la toxoplasmose chronique, est présente à l’intérieur de kystes qui apparaissent 7 à 10 jours après l’infection. Ces kystes mesurent environ 100 µm de diamètre et contiennent plusieurs milliers de parasites. On les trouve majoritairement dans le système nerveux central et dans les muscles, où ils peuvent perdurer pendant toute la vie de l’hôte.
Le sporozoïte est issu de la reproduction sexuée. Il est contenu dans l’oocyste, qui constitue une forme de résistance du parasite dans le milieu extérieur.
Le passage d’une forme à l’autre s’opère en fonction de l’hôte et de son statut immunitaire. Chez l’hôte intermédiaire, l’ingestion de kystes ou d’oocystes provoque la libération de parasites (bradyzoïtes ou sporozoïtes) dans le tractus digestif, qui se différencient en tachyzoïtes (Dubey et al., 1998). Ces derniers envahissent les cellules adjacentes et s’y multiplient activement. Ils infectent en particulier les cellules du système réticulo-histiocytaire, ce qui permet une dissémination rapide de l’infection par voie lymphatique et sanguine vers les ganglions, la rate et le foie. C’est la phase aiguë de l’infection. Le plus souvent, la réponse immunitaire de l’hôte permet le contrôle de cette infection. Les tachyzoïtes se différencient alors en bradyzoïtes, qui persistent à vie sous forme latente enkystée. C’est la phase chronique de l’infection.
I- 2- Pathogénicité
La toxoplasmose est une anthropozoonose qui constitue un problème de santé humaine aussi bien que vétérinaire. La prévalence de cette maladie dans la population humaine varie d’un pays à l’autre, en fonction des groupes ethniques, des habitudes alimentaires et des conditions d’hygiène. En Amérique du Nord, la prévalence est inférieure à 30% alors qu’en France, 45% environ de la population est séropositive. L’infection est habituellement asymptomatique chez l’hôte immunocompétent mais peut s’avérer gravissime dans les cas d’immunosuppression (Luft and Remington, 1992) ou de primo-infection au cours de la grossesse (Swisher et al., 1994).
I- 2- 1- Chez les sujets immunocompétents
La phase aigüe de l’infection peut parfois se traduire par un syndrome pseudo-grippal accompagné ou non d’adénopathies (Montoya and Liesenfeld, 2004). Lors de la phase chronique, les kystes contenant les bradyzoïtes sont généralement bien tolérés par l’organisme. Néammoins, des études récentes montrent que l’infection par T. gondii constituerait un facteur de vulnérabilité dans le déclenchement de troubles du comportement, en particulier dans le développement de la schyzophrénie (Torrey and Yolken, 2007).
En Guinée française, 44 patients immunocompétents ont récemment développé une toxoplasmose sévère allant jusqu’au décès de l’un d’eux. Les isolats parasitaires responsables n’ont pu être classés parmi les génotypes actuellement connus et ils sont donc considérés comme « atypiques » (Ajzenberg et al., 2004).
I- 2- 2- Toxoplasmose de l’immunodéprimé
Chez les individus immunocompétents, la réponse immunitaire de l’hôte restreint la dissémination des parasites qui s’enkystent dans le cerveau et dans les muscles. En cas de déficit de l’immunité cellulaire (atteinte par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), chimiothérapie ou traitements immuno-suppresseurs), il peut y avoir réactivation des parasites qui se différencient en tachyzoïtes et se multiplient au niveau cérébral, ce qui peut provoquer une encéphalite mortelle si elle n’est pas rapidement traitée. Ces cas de réactivation représentent la deuxième infection opportuniste chez les malades du SIDA dont l’immunodéficience est avancée, après la pneumocystose pulmonaire (Jones et al., 1996).
I- 2- 3- Toxoplasmose congénitale
Si une femme enceinte non immunisée est confrontée au parasite, elle peut développer une infection aiguë qui sera contrôlée par son système immunitaire. Par contre, le fœtus peut être contaminé par voie trans-placentaire, or son système immunitaire est immature et l’empêche de réagir contre le parasite. La transmission au fœtus est d’autant plus fréquente que la contamination de la mère est tardive par rapport à la fécondation (Vogel et al., 1996). Mais, inversement, l’atteinte fœtale est d’autant plus sévère que la contamination est précoce. En cas d’infection précoce de la mère, la plus fréquente des complications est l’encéphalomyélite qui peut provoquer la mort in utero et l’avortement spontané.
La forme congénitale de la toxoplasmose est également un problème vétérinaire important puisqu’elle est responsable de nombreux cas d’avortements spontanés dans les élevages ovins et caprins (Buxton, 1998).
I- 3- Etat actuel de la recherche anti-toxoplasmique
I- 3-1- Traitements existants
Une molécule efficace dans le traitement de la toxoplasmose doit être capable d’une part d’atteindre les différents tissus où prolifère le parasite, et d’autre part, de traverser la membrane plasmique de la cellule-hôte, la membrane de la vacuole parasitophore ou la paroi du kyste. Actuellement, c’est l’association de la pyriméthamine avec la sulfadiazine qui a montré les résultats les plus encourageants (Katlama et al., 1996). Cette association bloque le métabolisme de l’acide folique et limite donc la production d’acides nucléiques nécessaires à la multiplication du parasite. Cependant, l’utilisation de ces drogues entraîne des effets secondaires importants, et doit donc être limitée, notamment chez la femme enceinte. De plus, ces traitements n’ont aucun effet sur les kystes, ce qui nécessite de ne pas interrompre le traitement par crainte de réactivation des parasites. D’autres molécules comme les macrolides ou l’atovaquone offrent des alternatives intéressantes dans le traitement de l’infection. De plus, de nouvelles voies de traitements sont à l’étude. Par exemple, la découverte chez T. gondii d’un organite d’origine végétale spécifique des Apicomplexa, l’apicoplaste, a soulevé la possibilité d‘utiliser des dérivés d’herbicides comme drogues anti-parasitaires (Maréchal and Cesbron-Delauw, 2001).
I- 3- 2 Vaccination
Actuellement, il n’existe pas de vaccins contre la toxoplasmose humaine. Un vaccin basé sur l’infection par une forme atténuée de parasite (souche S48), incapable de se différencier en bradyzoïte, est employé avec succès pour lutter contre la toxoplasmose congénitale chez le mouton (Buxton and Innes, 1995). Chez l’homme, la vaccination par des parasites vivants est délicate à cause des risques de réactivation dont les conséquences sont encore mal évaluées. La recherche se tourne donc vers l’identification de molécules induisant la réponse immunitaire au cours de l’infection, afin de les utiliser comme candidats vaccinaux. Deux grandes classes d’antigènes sont principalement considérées :
- l’antigène de surface SAG1 est considéré comme l’antigène immunodominant de la forme tachyzoïte. Des expériences d’immunisation avec l’antigène SAG1 purifié ont donné des résultats contradictoires, et retardent l’utilisation de cette molécule comme vaccin (Kasper et al., 1985 ; Khan et al., 1991).
- les antigènes d’excrétion-sécrétion (AES) représentent 90% des antigènes circulants, et sont fortement immunogènes. Ces molécules sont à la fois synthétisées au stade tachyzoïte et bradyzoïte, ce qui en fait de bons candidats à l’établissement d’une immunité de prémunition développée lors de la toxoplasmose. La production d’anticorps monoclonaux contre les composants des AES a montré que les protéines de granules denses (protéines GRA) se trouvent en majorité dans les AES. L’antigène GRA2, notamment, est considéré comme un bon candidat vaccinal (Prigione et al., 2000 ; Zhou et al., 2007).
II-Toxoplasma gondii : une cellule infectieuse très compartimentalisée
En tant que parasite intracellulaire obligatoire, T. gondii a développé des mécanismes lui permettant d’envahir efficacement une cellule-hôte et de survivre à l’intérieur de celle-ci. T. gondii est capable d’envahir potentiellement tous les types cellulaires. L’invasion est un phénomène actif, qui aboutit à la création d’une vacuole parasitophore (VP) isolée du trafic cellulaire, dans laquelle le parasite va pouvoir se multiplier. Ces propriétés d’adaptation à l’environnement intracellulaire reposent sur une structure particulière qui présente une polarisation marquée, avec une extrémité antérieure effilée et une extrémité postérieure arrondie. Les évènements moléculaires impliqués font intervenir la sécrétion coordonnée des différents organites spécialisés de T. gondii que sont les micronèmes, les rhoptries et les granules denses (GD) (Fig. 2). Dans un premier temps, les micronèmes sont sécrétés et les protéines de micronèmes exposées à la surface se lient à des récepteurs de la cellule-hôte. L’exocytose des rhoptries coïncide avec la formation de la jonction mobile, à travers laquelle le parasite se propulse dans la VP naissante. Enfin, la libération du contenu des GD permet la maturation de la VP.
Fig. 2 : Représentation schématique des différentes étapes de l’invasion (d’après Dubremetz et al., 1998).
II-1- Organisation subcellulaire du zoïte
La description de la structure et des composants du zoïte de T. gondii est basée sur la revue de Lebrun, Carruthers et Cesbron-Delauw (Lebrun et al., 2007).
Le zoïte est le stade infectieux de tous les Apicomplexa. A quelques exceptions près, les organites décrits dans le cas de T. gondii sont donc communs à tous les membres du phylum. Le zoïte est une cellule hautement différenciée comprenant les organites classiques de toute cellule eucaryote : un noyau dans sa moitié supérieure, un réticulum endoplasmique (RE), un appareil de Golgi et une mitochondrie unique (Fig. 3). Les substances de réserve sont composées de globules lipidiques et de grains d’amylopectine, plus abondants chez les bradyzoïtes. Le zoïte est délimité par une membrane plasmique associée à un complexe membranaire interne (IMC) constitué de deux membranes étroitement accolées. Il possède des organites particuliers, parmi lesquels on trouve un plaste non photosynthétique, l’apicoplaste, ainsi que trois types organites de sécrétion : les micronèmes, les rhoptries et les GD.
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