1 Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement aux pH suivants : 1; 4,76; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76). 2





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Exercice 3 : La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxyméthyls (-CH2-COOH).

Questions :

1 - Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76).

2 - Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose à pH 7 ? (On considérera que les interactions protéine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre électrostatiques).

Correction exercice 3 :

1 - Proportion des groupements carboxyméthyls (pKa = 4,76) chargés négativement aux pH : 1, 4,76, 7 et 9.

Le pH est donné par la relation suivante :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/phpka.gif


À pH = 1 :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/logbsura.gif

= pH - pKa = 1 - 4,76 = -3,76    donc :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/bsura.gif

= 1,74 10-4


Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 1,74 10-4.(A),    on en déduit que (A) + 1,74 10-4.(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 1,74 10-4)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,98 % et (B) = 0,02 %



À pH = 4,76 :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/logbsura.gif

= pH - pKa = 4,76 - 4,76 = 0    donc :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/bsura.gif

= 1


Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A),    on en déduit que (A) + (A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %



À pH = 7 :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/logbsura.gif

= pH - pKa = 7 - 4,76 = 2,24    donc :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/bsura.gif

= 173,78


Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A),    on en déduit que (A) + 173,78(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(174,78)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) = 99,425 %



À pH = 9 :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/logbsura.gif

= pH - pKa = 9 - 4,76 = 4,24    donc :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/bsura.gif

= 13378


Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A),    on en déduit que (A) + 13378(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(13379)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 5,73 10-3 % et (B) = 99,994 %

Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-CH2-COOH).

À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme basique (-CH2-COO-)

2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,425 % sous forme basique, chargée négativement (-CH2-COO-).

Protéine :

Ovalbumine
Cytochrome c
Lysozyme

pHi :

4,6
10,65
11

Charge à ph = 7 :

négative
positive
positive



Ainsi, seule l'ovalbumine, qui à pH = 7 est chargée négativement, ne sera pas retenue sur la colone. Le cytochrome c et le lysosyme seront retenus.

Exercice 4 : La diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d'anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements diéthylaminoéthyls :




CH2-CH3




/

-CH2-CH2- NH+







\




CH2-CH3



Questions :

1 - Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargés positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considérera que le pK de l'amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4).

2 - Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (pHi = 4,9), Uréase (pHi = 5), Chymotrypsinogène (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considérera que les interactions protéine-DEAE-cellulose sont uniquement de type électrostatiques).

Exercice 4 : La diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d'anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements diéthylaminoéthyls :




CH2-CH3




/

-CH2-CH2- NH+







\




CH2-CH3



Questions :

1 - Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargés positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considérera que le pK de l'amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4).

2 - Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (pHi = 4,9), Uréase (pHi = 5), Chymotrypsinogène (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considérera que les interactions protéine-DEAE-cellulose sont uniquement de type électrostatiques).

Exercices de chromatographie :


Correction exercice 4 :

1 - Proportion des groupements diéthylaminoéthyls (DEAE : pKa = 9,4) chargés négativement aux pH : 2, 7, 9,4 et 12.

Le pH est donné par la relation suivante :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/phpka2.gif


À pH = 2 :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/logbsura.gif

= pH - pKa = 2 - 9,4 = -7,4    donc :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/bsura.gif

= 3,98 10-6


Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10-6.(A),    on en déduit que (A) + 3,98 10-6.(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10-6)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = environ 100 % et (B) = 0 %



À pH = 7 :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/logbsura.gif

= pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4    donc :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/bsura.gif

= 3,98 10-3


Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10-3.(A),    on en déduit que (A) + 3,98 10-3.(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10-3)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,996 % et (B) = 0,004 %



À pH = 9,4 :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/logbsura.gif

= pH - pKa = 9,4 - 9,4 = 0    donc :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/bsura.gif

= 1


Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A),    on en déduit que (A) + (A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %



À pH = 12 :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/logbsura.gif

= pH - pKa = 12 - 9,4 = 2,6    donc :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/bsura.gif

= 398,1


Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 398,1(A),    on en déduit que (A) + 398,1(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 398,1)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,25 % et (B) = 99,75 %

Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-NH+).

À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme basique (-N)

2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,996 % sous forme acide, chargée positivement.

Protéine :

Sérumalbumine
Uréase
Chymotrypsinogène

pHi :

4,9
5
9,5

Charge à ph = 7 :

négative
négative
positive



Ainsi, à pH = 7 la sérumalbumine et l'uréase sont chargées négativement, et seront donc retenues sur la colone. Le chymotrypsinogène ne sera pas retenus.

Exercice 5 : Le coefficient de partage de l'iode (I2) entre les deux solvants non-miscibles : tétrachlorométhane et eau, est égal à 100 à 25 °C. À 10 ml de solution aqueuse d'iode à 10 g/l, on ajoute 10 ml de tétrachlorométhane (CCl4).

Donnée : I2 est plus soluble dans le tétrachlorométhane que dans l'eau.


Question : Déterminer la concentration en iode dans le tétrachlorométhane et dans l'eau, après agitation et décantation.

Correction exercice 5 :

Coefficient de partage de l'iode dans le tétrachlorométhane et l'eau.

D'après les données de l'exercice, on peut écrire les deux égalités suivantes :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/cor5.gif

On peut en déduire que :

http://www.123bio.net/cours/chromato/images/cor52.gif

Concentration dans le tétrachlorométhane (solvant organique) = 9,9 g/l

Concentration dans l'eau (solvant aqueux) = 0,099 g/l

Exercice 6 : On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d'une protéine p par chromatographie d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM.

L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les volumes d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant :

 

MM (Da)

Ve (ml)

Dextran

2000000

45

Fibrinogène

340000

60

Catalase

230000

75

Lactoglobuline

19000

132


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