Cette technique consiste à utilisé plusieurs électrode et on change régulièrement l’orientation de champ électrique et/ou de polarité du champ de manière
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| Cette technique consiste à utilisé plusieurs électrode et on change régulièrement l’orientation de champ électrique et/ou de polarité du champ de manière alternative au cour du temps. Avec une concentration d’agarose, les mailles font 1 µm. Avec un ADN étiré de 50kb soit de 18µm de long en étant étiré, alors sa migration sur le gel va se déplacer d’une de ses extrémités en reptation (= rampe en se faufilant de manière allongé) pour passer entre les mailles. Lorsque l’on met le champ électrique, on a un allongement d’ADN dans le sens du champ électrique. L’effet de la taille du pore va bloquer l’ADN donc la vitesse de migration sera constante et donc il n’y aura pas de pouvoir de séparation du gel. En champ pulsé, on utilise un champ d’agarose à 1 %. A chaque changement de sens de courant, l’ADN s’oriente de manière parallèle au champ électrique. Au fur et à mesure que l’on change de sens du champ, l’ADN va mettre un certain temps à se réorienter et on s’aperçoit que le temps de réorientation est proportionnel à la longueur de la molécule d’ADN et plus cette molécule est grosse et plus on au retard dans la migration de cette ADN.  La flèche violette indique le sens du champ du champ électrique et les brins d’ADN sont en bleu. On peut utiliser cette méthode pour séparer des grands ADN voire des chromosomes en entier. L’électrophorèse permettra migration d’espèces électriques chargées, dissoutes ou suspendues dans un électrolyte,) à travers lequel passe un courant électrique. III) Electrophorèse capillaire (= capillary electrophoresis noté CE) : -Elle permet la séparation d’espèces ioniques dans un tube capillaire rempli d’un électrolyte. On à une migration essentiellement dans un champ électrique. On a une séparation du composant par CE qui dépend de la migration différentielle des analytes dans un champ électrique appliquée et la vitesse de migration électrophorétique Up d’un analyte vers l’électrode de charge inverse peut-être : Up = µp.E avec µp qui est la mobilité électrophorétique et E la force du champ électrique. La mobilité électrophorétique µp est proportionnelle à la charge ionique de l’échantillon et est inversement proportionnelle à toute force de friction. Les forces de friction présente dans le tampon sont : la viscosité du milieu, la taille et la forme de l’ion. La séparation par CE repose sur la présence d’un flux de solution électriquement induit dans le capillaire, le flux électroosmotique (EOF), pour pomper les solutés vers le détecteur. Ce capillaire est remplit d’une solution d’électrolyte qui conduit le courant à l’intérieur du capillaire. Pour faire une CE, on utilise un voltage très élevé (de 15 à 30 kV) car la chaleur produite peut-être évacué très rapidement. On à des injections de très petites quantité d’échantillon. Les ions positifs ou négatifs peuvent être attirés à travers le capillaire dans le même sens par EOF. Les analytes sont séparés pendant leur migration car la mobilité électrophorétique est différente. Tous passent devant un détecteur à proximité de la sortie du capillaire et un signal sera envoyé à une plate forme de traitement de données. L’efficacité de séparation est seulement limité par la diffusion et est proportionnel à l’intensité du champ électrique. On à ici une méthode de séparation rapide, de haute résolution avec une détection très sensible. Cette méthode est utilisée pour des analyses pharmaceutiques et pour la séparation de biomolécules (ADN et protéine). La CE induit : - une utilisation d’un équipement d’analyse automatisé - un temps d’analyse très court (utilisation de haut voltage) - une détection en temps réel de pics séparées (capillaire inséré dans le centre optique d’un détecteur) - utilisation de plate forme de traitement de signal (utilisé pour séquencer) On peut avoir une coloration au bleu de Coomasie. Si les protéines sont spécifiques, on utilise des anticorps spécifiques.  IV) « Blotting » et applications Application : blotting ou effet buvard Dans ce cas, on réalise une réplique exacte de gel sur membrane. On à donc une détection spécifique (sonde ou anticorps). On a donc : - séparation ADN, ARN, ou protéines par électrophorèse - transfert de la réplique du gel sur une membrane - localisation (hybridation) - révélation des molécules d’intérêts On a différentes membranes de transfert :
Acides nucléiques, protéines (limite le passage à travers les membranes)
On a des analyses d’ADN (Southern Blot), d’ARN (Northern Blot) et de protéines (Western Blot)
Par cette méthode on a une détection spécifique de protéines rares. Les constituants protéiques abordant (actine et tubuline) sont facilement détectés. Les protéines de signalisation sont des facteurs de transcription. Ce sont des molécules très importante MAIS très peu représenté (<0.1% des protéines cellulaires totales). On a donc une détection des espèces rares ou de variation d’expression protéique de faible intensité. On à le gel au contact de membrane et on fait un transfert par l’électricité pour que les protéines du gel soit bloqué par la membrane en migrant. Le courant va aller de la cathode à l’anode et les protéines vont suivre le courant électrique et seront bloqué par le gel. Sur la membrane, on à une réplique exacte des protéines bloqué sur le gel. Cette membrane sera recouverte d’anticorps, puis on aura un rinçage puis révélation pour trouvé les anticorps qui sont resté fixés. Avec la membrane, on peut faire une quantification par mesure de la densité optique.
Par cette méthode, on à une détermination de l’ordre d’enchaînement des nucléotides dans un fragments d’ADN. On a un technique traditionnelle de séquençage d’ADN (méthode de Sanger et la méthode de Maxan-Gilbert) utilisant des gels de polyacrylamide. Par cette méthode, on ne sépare les fragments d’ADN ne différent que d’une paire de base (pb). - La méthode de Sanger : l’ADN à séquencer est utilisé comme matrice pour la synthèse in vitro, par l’ADN polymérase. On a une série de réplique partielle pour la chaîne de l’ADN qui commencent au même endroit et se termine en différents points. La synthèse d’ADN est réalisée en présence de nucléotides (dNTP). On a des nucléosides tri-phosphate de terminaison de chaîne, le didéoxyribonucléosides tri-phosphate (ddNTP) et on a une absence de groupement 3’OH du désoxyribose. On à aussi un incorporation d’un ddNTP qui bloque l’addition de DNTP suivant. La synthèse d’ADN se fait en présence de dCTP, dATP, dTTP, dGTP et de petites quantité de ddNTP (incorporation rare). - La méthode Maxan-Gilbert : Concerne les fragments d’ADN jusqu’à 500 nucléotides. On a un fragment intact marqué au P32 en 5’ (qui sont les seuls fragments à être détecté par autoradiographie).
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